刘小伟[1]2004年在《兔角膜内皮细胞移植和自体骨髓间充质干细胞替代移植治疗角膜内皮损伤的初步研究》文中指出目的：分离培养兔角膜内皮细胞(Corneal endothelial cells CECs)和骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells MSCs)，观察它们体外生长情况；通过兔CECs移植证明利用明胶(Gelatin)膜载体进行CECs移植治疗角膜内皮损伤的可行性和初步效果，同时初步研究自体MSCs移植到兔角膜内皮细胞部位后其形态和功能的分化。 方法：采用揭膜联合胰蛋白酶消化法分离CECs；光镜和电镜对细胞进行观察；原代CECs用Brdu标记后接种在Gelatin膜载体上；利用α—氰基丙烯酸脘基酯作为组织黏合剂，将接种有CECs的载体与机械去除了内皮细胞的自体兔角膜植片相粘合，原位缝合进行兔眼CECs移植；采用骨髓穿刺密度梯度离心方法分离兔自体骨髓MSCs；并利用PE标记的CD_(45)和FITC标记的CD_(44)单克隆抗体对体外培养的骨髓MSCs进行鉴定；同样的方法用MSCs替代CECs进行移植；对照眼移植没有接种任何细胞的载体膜。术后在不同的时间点观察兔眼角膜移植片的透明情况、角膜厚度和眼压，并利用共焦显微镜进行移植细胞的形态观察和精确计数。术后观察12周，处死动物，角膜标本分别进行组织切片、抗Brdu单克隆抗体免疫组化染色和电镜观察。 结果：揭膜联合胰蛋白酶消化法可以获得高纯度的角膜内皮细胞，体外培养48小时后细胞大部分贴壁，贴壁率54.3％，7～10天基本汇合；细胞呈多角型，排列紧密，有明显的接触抑制。而骨髓穿刺密度梯度离心法获得的MSCs，体外培养96小时内贴壁生长，贴壁率约25.5％；原代培养的前5～6天为细胞的潜伏期，7～12天为细胞的指数增生期，之后进入平台期，大多在14～17天汇合；细胞呈单一的成纤维细胞外观，长梭形，排列呈漩涡状；体外培养的MSCs CD_(45)表达阴性，而CD_(44)表达阳性，纯度可达到94％左右。CECs和MSCs在Gelatin膜载体上生长良好，体外培养3～5天后细胞汇合，细胞密度CECs可以达到
陈义[2]2010年在《脐带间充质干细胞培养及体外重建角膜后板层的初步研究》文中研究表明目的(1)应用改良及传统培养方法体外培养兔角膜基质细胞和人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs),观察其生物学特性,为下一步角膜后板层重建奠定基础。(2)探讨以板层猪角膜基质后弹力层面为载体培养人脐带间充质干细胞初步构建组织工程角膜后板层的可行性,为组织工程角膜后板层的构建提供新的种子细胞来源和适宜的载体材料。方法(1)采用新培养法—悬浮基质片法及传统方法对兔角膜基质细胞进行分离、培养及鉴定。(2)采用新培养法—脐带组织片悬浮法及传统方法对人脐带MSCs进行分离、纯化、扩增、传代,观察其体外生长特征。(3)采用流式细胞术对体外培养的人脐带MSCs进行免疫表型鉴定,并行成脂细胞和成骨细胞诱导分化,鉴定其干细胞特性。(4)将第五代脐带MSCs接种于去除内皮细胞的板层猪角膜基质后弹力层面上进行培养。(5)待细胞融合形成单层后,观察接种后细胞的生长特性,3周后行HE染色及扫描电镜、透射电镜等对细胞进行形态学观察。免疫组化法检测接种后干细胞角膜内皮细胞抗原标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。结果(1)新的培养方法—悬浮基质片法及脐带组织片悬浮法可成功培养出角膜基质细胞及脐带间充质干细胞,较传统方法便捷、可靠。体外培养的角膜基质细胞及脐带MSCs均呈成纤维细胞形态,增殖活力好。(2)流式细胞仪示：培养的人脐带MSCs表达间充质干细胞的特异标记包括CD13、CD29、CD44、CD105,但不表达造血和内皮细胞的标志CD31、CD34、CD45。经体外诱导证实,人脐带MSCs具有向脂肪细胞及成骨细胞方向分化的能力。(3)将传代后的人脐带MSCs接种于板层猪角膜基质后弹力层面上进行培养,细胞可在后弹力层面贴附,单层生长良好；电镜下见细胞表面微绒毛丰富,细胞之间紧密连接,富含细胞器。经培养3周后部分干细胞表达角膜内皮细胞抗原标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)。结论(1)本研究探讨了兔角膜基质细胞和人脐带MSCs体外分离、培养的改良方法,体外培养的角膜基质细胞和脐带MSCs均呈成纤维细胞形态,具有较强增殖能力。(2)体外培养的人脐带间充质干细胞,具有多向分化潜能。以板层猪角膜基质后弹力层面为载体可成功培养人脐带间充质干细胞,构建出与正常角膜后板层相似的组织,有望为组织工程角膜后板层重建提供一种新的种子细胞来源和适宜的载体材料,并为进一步深入进行功能性研究和移植提供了实验基础。
姜河[3]2008年在《骨髓间充质干细胞与脱细胞角膜基质构建组织工程角膜研究》文中指出本实验以体外培养并纯化的骨髓间充质干细胞为种子细胞,与自制的脱细胞角膜基质支架材料附和,并经形态学观察与动物移植检验其生物特性和组织相容性;对角膜上皮细胞的体外培养体系进行了探讨,并采用Transwell共培养体系诱导骨髓间充质干细胞向角膜上皮细胞方向分化;旨在通过对种子细胞和支架材料的系统研究,以探索有效的组织工程角膜制备方法,为临床组织工程角膜制备和应用提供依据。具体操作和结果如下:1.密度梯度法分离幼兔骨髓间充质细胞,以DMEM/F12为基础培养基,添加10% FBS,100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素,PH 7.2~7.4,37℃饱和湿度进行培养,原代培养第2天,可见大量成纤维样细胞贴壁密集生长,镜下观察成旋涡状,第5天可以传代,选择第2或3代贴壁细胞作为种子细胞。实验显示培养的骨髓间充质干细胞表现出良好的生长和分化性能,可作为较理想的组织工程种子细胞。2.采用胰酶和DNA酶联合消化法对猪角膜进行脱细胞处理,经液氮反复冻融,促使角膜内的各种细胞破裂,彻底脱除角膜细胞成分,冻干保存得到支架材料;生物学检验显示,冻干支架材料呈白色疏松片状形态,厚约1-2 mm;DMEM复水3 h后呈半透明且与正常角膜韧性、厚度和强度相近;光镜下观察显示角膜上皮与基质中的细胞脱除完全,无残留,上皮基底膜完整,胶原纤维无断裂,结构疏松,整体成网状结构;扫描电镜观察可见脱细胞基质胶原板层结构完整,材料呈叁维立体网格状结构;细胞培养附和实验观察到种子细胞可以在基质上良好生长;将支架材料移植到角膜缘干细胞完全缺失动物病理模型眼表以观察其生物相容性及对眼表恢复效果,结果未见明显的炎症反应与排斥,角膜生长良好。3.无菌取家兔全层角膜,用含各100 U/mL青霉素和链霉素的PBS冲洗后,经1.2U/mL DispaseII酶消化,用含血清的培养基中和终止消化。剥离角膜上皮组织,弃去基质,离散细胞,离心后弃上清,加入适量含10% FBS,20 ng/mL EGF, 5 ng/mL胰岛素的培养液,制成浓细胞悬液,接种于塑料培养瓶;37℃5% CO2饱和湿度,每48 h换液,待细胞增殖铺满瓶底80%～90%时进行传代,得到角膜上皮细胞。采用Transwell共培养体系对角膜上皮细胞和BMSC进行非接触式共培养,形态学观察显示培养15d左右,细胞由成纤维样形态变成铺路石样,显示骨髓间充质干细胞在体外被诱导分化为角膜上皮细胞。
崔燕[4]2013年在《恒河猴骨髓间充质干细胞体内及体外诱导为角膜内皮细胞的研究》文中研究指明目的将体外培养的恒河猴骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)移植于角膜内皮细胞失代偿的角膜内表面,分时段观察细胞形态及功能改变,分析体内诱导BMSCs致角膜内皮细胞化的可行性。同时对BMSCs诱导为角膜内皮细胞(Corneal endothelial cells, CECs)的体外环境条件进行初步探索。方法恒河猴8只,随机分为两组：实验组(6只)、对照组(2只)；应用超声乳化技术破坏CECs制作角膜内皮细胞功能失代偿模型。采用密度梯度离心法分离培养幼猴BMSCs,经鉴定、Brdu标记后应用前房注射法移植入损伤后的角膜内表面。术后观察角膜透明度、眼压、角膜水肿程度、角膜及虹膜有无新生血管、前房深度、瞳孔大小、房水浑浊程度,主观上观察BMSCs移植后对正常角膜组织结构及代谢功能的影响；术后1月、2月、3月摘取术眼角膜植片进行病理切片(HE染色)、扫描电镜及透射电镜检测,从客观上观察替代移植后BMSCs的分布状况、形态学改变、连接状态及生长趋势；行抗Brdu单克隆抗体免疫组织化学染色及神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色,以判断角膜植片内表面的细胞是否为移植的细胞,以及移植后的细胞是否表达角膜内皮细胞特异性表面分子。揭膜消化法分离培养幼猴角膜内皮细胞,形态学观察及NSE免疫组化染色法进行鉴定；采用BMSCs和CECs置于Transwell非接触共同培养体系以及应用含有角膜内皮失代偿恒河猴前房水的培养基对BMSCs进行培养两种方式对BMSCs进行体外诱导,观察BMSCs形态学变化并采用NSE免疫组织化学染色行细胞鉴定。结果超声乳化损伤角膜内皮后成功建立了角膜内皮功能失代偿模型,角膜透明度逐渐下降。实验组BMSCs移植入前房后,实验组角膜透明度于2周后开始逐渐增加。电镜观察见：1月时细胞成迭加生长,细胞间连接较少；2月时细胞间连接较前增加；3月时细胞类似单层生长,细胞间连接较多,但存在细胞窗；形态上细胞逐渐由长梭形向短梭形及多边形靠拢。对照组角膜混浊不能恢复,可见新生血管长入；电镜下观察见后弹力层裸露,无细胞覆盖,偶可见残存角膜内皮细胞,贴附不牢固。体外诱导的两种方法：Transwell共培养法及房水-培养基诱导法,分别于第3周及第2周采用NSE法鉴定出阳性结果,细胞形态上改变不甚明显；重复诱导一次结果相同。结论体外培养的同种异体BMSCs采用改良的前房注射法植入损伤后的恒河猴角膜内表面后可在一定程度上替代角膜内皮细胞,发挥它的泵功能,且能部分表达内皮细胞表面相关蛋白。Transwell非接触共培养及房水-培养基法均可体外诱导BMSCs分化为角膜内皮样细胞。
施文建[5]2010年在《以猪角膜板层为载体诱导人骨髓间充质干细胞治疗兔角膜损伤的初步研究》文中研究表明目的探讨以猪角膜前板层基质为载体诱导人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)治疗兔角膜损伤的可能性。方法用全骨髓贴壁法分离纯化人MSCs,将细胞接种于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养扩增,传代,流式细胞仪检测免疫表型及诱导成脂、成骨分化,采用油红O及硝酸银染色鉴定。自动板层角膜刀钻取直径约7.5 mm,厚160μm的去上皮猪角膜基质片。28只新西兰白兔随机分为2组,制作角膜广泛损伤模型。实验组取第3代MSCs接种于去上皮和全周角膜板层缘的猪角膜基质上,培养4天后移植到广泛损伤的兔角膜上,对照组单纯移植去上皮猪角膜基质。术后2、4、8周观察实验眼角膜透明度和新生血管并评价分析。术后2、4、8周,取各实验眼行组织学检查,观察移植的MSCs及猪角膜基质的存活、转归及移植局部的反应。免疫组织化学、免疫荧光染色检测移植后角膜上皮细胞标志物细胞角蛋白12(Cytokeratin 12, CK12)的表达。结果获得的细胞流式细胞仪检测：CD29阳性率为95.97%,CD44为96.49%,CD90为92.79%,CD105为94.66%,CD34为0.59%,CD45为0.36%。符合MCSs的免疫表型,并可以诱导成脂及成骨分化。接种到去上皮猪角膜基质后贴附、生长迅速。术后植片在植床上存活良好,未见明显排斥反应,实验组角膜较对照组明显透明,新生血管少。实验组角膜免疫组织化学及免疫荧光均检测出CK12阳性细胞。结论人骨髓MSC可以在体外成功进行原代和传代培养,体外培养的人骨髓MSC有很强的增殖能力。种植MSCs的猪角膜基质移植到损伤兔角膜后可以存活并减少兔角膜新生血管、增加透明度,本实验条件下MSCs可以分化为角膜上皮样细胞,可能具有构建组织工程角膜的潜能。
乔丽萍[6]2007年在《骨髓间充质干细胞移植促进兔角膜缘碱烧伤愈合机制的实验研究》文中研究表明研究目的旨在探讨培养、纯化、扩增骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MMSCs)最佳条件和方法;研究MMSCs在体内的分布,作用时间,作用方式,MMSCs与体内微环境之间的关系及MMSCs促进角膜缘碱烧伤创伤愈合的机理。研究方法本课题分叁部分。第一部分采用常规实验室方法观察培养MMSCs;第二部分新西兰大白兔40只(眼),分为两组,每组各20只(20眼)。采取随机双盲。一组为正常对照组,一组为角膜缘碱烧伤组,在移植术后第3、21、60天,检查外周血MMSCs数量变化,在共聚焦显微镜下观察MMSCs全身脏器的分布;第叁部分采用角膜缘碱烧伤模型作为实验主体,选择健康无任何眼疾的新西兰大白兔60只(眼),分为两组,每组各30只(30眼)。采取随机双盲。一组为对照组,耳缘静脉注射PBS,作为空白对照;一组为移植组,耳缘静脉移植MMSCs。在移植术后第3、21、60天,用裂隙灯观察角膜新生血管、上皮再生、角膜透明程度;采用普通病理学进行组织病理学检查;应用WesternBlot行TIMP-2检测;免疫荧光染色,在共聚焦显微镜下行移植细胞鉴定、定位和定性检查PCNA、CD44、CD45、MMP-2/TIMP-2、Vimentin、α-SMA、Keratin-pan、CD31抗体表达情况;RT-PCR半定量法检测VEGF、VEGFR、IL-2mRNA表达水平;ELISA检测外周血与房水中VEGF、IL-2的浓度变化;流式细胞学检查外周血中MMSCs数量变化。结果第一部分1.MMSCs的增殖能力在5%～10%的胎牛血清浓度培养基中较高,差异有显着性(P<0.05);骨髓间充质干细胞表达CD90~+、CD29~+、CD44~+、CD34~+、CD106~+、HLA-I,不表达 CD45~-、CD31-、HLA-Ⅱ。其中CD90~+细胞含量在不同培养条件有所不同,随着细胞传代逐渐下降。2.MMSCs随着VEGF、IL-1的浓度增加,迁移率增高,二者呈正相关性(r=0.597;P<0.05),但迁移率随细胞传代次数的增加而下降,6代以后MMSCs迁移率明显降低。第二部分1.移植术后第3、21、60天,外周血中MMSCs的数量在角膜缘碱烧伤组(2.56±0.11;2.98±0.09;1.74±0.07),与正常对照组(0.86±0.05;0.65±0.07;0.54±0.04)相比较,均有显着性差异(P<0.05),且移植MMSCs的起始数量与外周血中MMSCs数量呈正相关(r=0.567;P<0.05)。2.移植术后第3、21、60天,角膜缘碱烧伤组,MMSCs数量由多至少依次为角膜缘、角膜中央、结膜、视网膜、脉络膜、虹膜;在角膜中,上皮层MMSCs较多,内皮细胞层MMSCs较少,在角膜缘MMSCs的分布有"聚集现象"。正常对照组,角膜、结膜、视网膜、脉络膜、虹膜可偶见到MMSCs,数量极少或没有。3.MMSCs移植后在体内分布显示:角膜缘碱烧伤组,移植第3天,MMSCs数量由多至少依次为肺、脾、肾、肝、肌肉、心、脑。第60天,MMSCs数量由多至少依次为肺、脾、肾、肝、心、肌肉、脑;肺脏中MMSCs数量变化有显着性差异(P<0.05);脾脏中MMSCs数量变化没有显着性差异(P>0.05)。正常对照组,移植第3天,在体内MMSCs的分布数量由多至少依次为肺、脾、肾、肝、肌肉、心、脑。移植第60天,数量由多至少依次为脾脏、肺脏、肾脏、肝脏、心肌、肌肉、脑。肺与脾中MMSCs数量变化有显着性差异(P<0.05)。第叁部分1.移植组角膜新生血管面积,术后第3、21、60天(12.56±0.46;19.16±0.76;4.36±0.66),与对照组相比(3.34±0.51;14.56±0.46;29.16±0.68),均有显着性差异(P<0.05);角膜混浊程度,术后第3天(2.8±0.2),与对照组(2.9±0.3)相比,无显着性差异(P>0.05);术后第 21、60 天(2.7±0.4;1.9±0.3)与对照组(3.1±0.2;3.5±0.4)相比较,均有显着性差异(P<0.05)。角膜上皮再生程度,术后第3、21、60 天(2.9±.045;2.7±0.39;2.1±0.43),与对照组相比(3.5±0.56;3.8±0.47;3.9±0.51),均有显着性差异(P<0.05)。2.移植组术后3天,外周血清中VEGF(98.23±1.45)、房水中的VEGF(145.12±2.01)浓度高于对照组(10.21±1.23;58.23±1.24),有显着性差异(P<0.05);第 21、60 天,外周血清(56.12±1.56;50.36±1.25)、房水(98.23±1.26;56.12±1.98)中的VEGF浓度低于对照组,有显着性差异(p<0.05);不同观察时间点,移植组IL-2在外周血及房水中的浓度均低于与对照组,有显着性差异(P<0.05)。3.RT-PCR半定量检测VEGF、VEGFR、IL-2mRNA表达水平,术后第3天,移植组角膜组织VEGF、VEGFR高表达,尤以VEGF明显;IL-2在移植组角膜组织中第3、21、60天持续低表达。4.移植组,角膜组织切片可见Dil~+MMSCs-CD31~+、Dil~+MMSCs-TIMP-2~+、Dil~+MMSCs-PCNA~+双阳性细胞存在。CD44 角膜中高荧光表达,CD45表达降低,Vimentin、α-SMA表达增高。Western blot显示角膜组织中高度表达TIMP-2蛋白质。角膜上皮高度表达Keratin-pan,曲线光滑,基底部完整,可见复层上皮细胞。结论1.将全骨髓种植于5%-10%血清培养基中,选择12-48小时贴壁的原代细胞进行消化传代,前4代MMSCss生长的形态、数量、分化能力、增殖力适宜做细胞治疗。MMSCs存在自然分化的生物特性。在体外VEGF、IL-1可增强MMSCs趋化运动能力。2.经全身静脉移植进入体内的MMSCs,脾脏是主要归巢场所。肺脏是外源性MMSCs主要截流场所。在角膜损伤时,MMSCs可定向归巢至角膜损伤处。3.MMSCs移植后早期,在角膜组织中表达了角膜缘干细胞的增殖特性(PCNA),上调了细胞因子VEGF,下调了炎症趋化因子,增加了黏附分子CD44表达,调节金属蛋白酶MMP-2/TIMP-2的平衡关系,从而改变角膜组织创伤愈合的微环境,最终达到了角膜透明性较好(Vimentin、α-SMA晚期表达较低),上皮完整(Keratin-pan高表达),新生血管减轻的治疗目的。4.异体移植MMSCs可抑制角膜缘碱烧伤后免疫系统异常反应。
余锦强, 柯峰, 李儒华, 凌佼佼, 华远峰[7]2014年在《兔自体骨髓间充质干细胞移植对角膜缘干细胞损伤的初步疗效研究》文中指出目的探讨兔自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对角膜缘干细胞(LSCs)损伤的初步疗效。方法 36只大白兔分为叁组:BMSCs组、LSCs组与羊膜对照组,每组12只。BMSCs组采用附着有BMSCs的羊膜治疗角膜缘干细胞损伤,LSCs组将附着有角膜内皮细胞的羊膜治疗角膜缘干细胞损伤,羊膜对照组则仅将羊膜用缝合线固定于浅层巩膜上治疗角膜缘干细胞损伤。于术前、术后1周、术后2周、3周和4周对眼表的形态进行评分;并于术前、术后1周、4周、8周利用聚焦显微镜观察细胞密度和表面积。结果在移植手术实施之前叁组兔的眼表形态综合评分之间的差异无统计学意义(P>0.05);手术之后4周BMSCs组和LSCs组兔的眼表形态评分得以显着改善,差异有统计学意义(P<0.05);手术之后4周羊膜对照组兔的眼表形态评分与手术前相比,差异无统计学意义(P>0.05);手术之后4周BMSCs组和LSCs组之间的眼表形态评分之间差异无统计学意义(P>0.05)。与羊膜对照组相比,其它两组手术4周之后的眼表形态评分改善更显着,差异有统计学意义(P<0.05)。经过共焦显微镜观察,BMSCs组兔移植1周之后的细胞形态为圆形,而非初始的梭边形,细胞较小,密度较高,而随着时间推移,个数逐渐减少,体积变大。随着时间的推移BMSCs组与LSCs组兔移植后的平均细胞密度出现下降。手术前BMSCs组与LSCs组细胞表面积差异无统计学意义(P>0.05);手术后1周、4周BMSCs组的细胞表面积显着低于LSCs组,差异有统计学意义(P<0.05),手术之后8周和12周时BMSCs组与LSCs组细胞表面积差异无统计学意义(P>0.05)。结论与角膜缘干细胞相似,兔自体骨髓间充质干细胞移植治疗角膜缘干细胞可以重建受损的眼表,减轻水肿,抑制血管生成。
姜廷帅[8]2007年在《体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为角膜上皮细胞的初步研究》文中研究指明研究背景与目的角膜上皮再生的来源是角膜缘干细胞,干细胞的缺失会导致严重的眼表异常,包括角膜新生血管、角膜结膜化、角膜溃疡穿孔以及带状角膜病变等。以自体或同种异体角膜缘移植,因供体来源不足及异体移植引起的排斥反应而受限;而单纯羊膜移植重建眼表,因无上皮再生来源的干细胞而不能治疗角膜缘严重受损的眼表伤。组织工程技术的发展为解决这一问题带来了希望。尽管大量研究用角膜缘干细胞作为种子细胞,但细胞来源的有限性使其应用和推广受到限制。研究表明,成年人骨髓中存在着多潜能性的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC),在体外不同条件下可以定向地被诱导分化为心肌细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、骨、软骨、肌腱及骨髓基质等不同细胞。这类细胞来源确切、充足,取材方便,分化潜能大,避免了胚胎干细胞可能面临的伦理学问题,并且因为是自体组织,所以不存在排斥反应,可能具有更加良好的应用前景。角膜基质是角膜上皮细胞和角膜缘干细胞的微环境,具有维持角膜上皮细胞特性的作用。角膜基质含有多种自分泌和旁分泌细胞因子及其受体,共同组成了角膜缘基质层复杂的细胞因子调控微环境,维持角膜缘干细胞的正常分化、繁殖和不进入终极分化。本实验的目的是利用组织工程技术体外培养骨髓MSC,与角膜基质细胞共培养诱导骨髓MSC向角膜上皮细胞转化,通过对骨髓MSC向角膜上皮细胞分化潜能的研究,探讨骨髓间充质干细胞作为构建组织工程化角膜种子细胞的可行性及其重建角膜上皮的可能性。方法(1)采用Percoll密度梯度离心培养技术结合贴壁培养法对大鼠骨髓间充质干细胞分离、纯化和原代、传代培养观察,免疫细胞染色。(2)对体外培养的大鼠骨髓MSC进行形态学观察、免疫荧光染色检测表面抗原标记,确认为培养的细胞为骨髓MSC。(3)观察大鼠骨髓MSC在体外微环境诱导下,横向分化为角膜上皮细胞的情况。将分离培养的大鼠骨髓MSC与角膜基质细胞在Transwell体系中进行共培养,使用免疫荧光技术检测共培养前后细胞的分化情况。结果大鼠骨髓MSC可以在体外培养扩增,表现出很强的增殖潜能。免疫荧光染色显示,原代培养的骨髓MSC CD29阳性,CD34、CD45和CK12为阴性,流式细胞仪显示,CD29阳性率为81.56 %、CD34为0.10 %、CD44为88.77 %、CD45为0.17%,CD71为10.02%、CD90为98.43、CD133为1.56%。符合骨髓MSC的特征。骨髓MSC与角膜基质细胞共培养1wk后大部分细胞分化为间质细胞,少部分细胞形态上相对偏小,免疫荧光检测这部分细胞表达角膜上皮细胞特异性标志角蛋白CK12。结论体外培养的大鼠骨髓MSC在角膜基质细胞的诱导下具有横向分化为角膜上皮细胞的潜能,有可能作为角膜上皮组织工程种子细胞的选择。
赵云[9]2016年在《骨髓间充质干细胞及其培养上清液对小鼠角膜碱烧伤修复作用的实验研究》文中研究说明目的:角膜碱烧伤是临床上常见的致盲性眼外伤。目前对于该病主要的有药物和手术两种治疗方法。这些治疗方法虽然取得了一定的疗效,但是在减轻碱烧伤后角膜混浊度,减轻角膜炎症反应和减少角膜新生血管方面的效果仍有待提高。骨髓间充质干细胞因其较强的增殖能力和多向分化潜能,加之潜在的抗炎和抗新生血管作用,成为了组织损伤疾病细胞治疗方法的理想种子细胞来源。骨髓间充质干细胞是否对于角膜碱烧伤具有一定的治疗作用,骨髓间充质干细胞培养上清液是否也具有治疗作用,目前国内外对于其在小鼠角膜碱烧伤方面的研究较少。本实验建立并验证了一种稳定可重复的小鼠角膜碱烧伤模型,并在此基础上探讨了应用结膜下注射骨髓间充质干细胞和骨髓间充质干细胞培养上清液点眼两种治疗方法对于角膜碱烧伤的治疗效果。方法:1.利用浸润于Na OH溶液的单层滤纸片贴附于小鼠角膜中央进行角膜碱烧伤,通过造模后裂隙灯检查眼表情况和HE染色检查,比较不同浓度Na OH溶液和不同滤纸片贴附时间下角膜碱烧伤的作用效果,从而选择一种相对稳定性强,一致性好的小鼠角膜碱烧伤动物模型制作方法。2.获得稳定可重复的小鼠角膜碱烧伤模型后,将实验小鼠分为叁组:分别是碱烧伤后给予球结膜下注射0.1ml含1×106个BMSCs的悬浮液的骨髓间充质干细胞治疗组;碱烧伤后每天给予6次骨髓间充质干细胞培养上清液点眼组;以及碱烧伤后每天给予6次PBS液点眼组。结膜下注射骨髓间充质干细胞组为碱烧伤造模后进行注射,点眼组为每天6次点眼,直至处死小鼠。3.造模后裂隙灯观察眼表情况变化:造模后早期第1天、第3天、第5天、第7天利用荧光素染色法观察角膜上皮愈合情况;造模后第3天、第7天、第14天、第21天、第28天观察角膜新生血管情况;造模后第3天、第7天、第14天、第21天、第28天进行中央角膜混浊度评分,共观察4周。4.造模后第3天、7天、14天和28天,通过HE染色法观察角膜组织变化情况、炎症反应和新生血管生成情况,并对中央角膜的基质细胞进行计数。5.造模后第28天,通过免疫组织化学染色法检测角膜组织中Ki-67、α-SMA、MMP-9的表达。研究结果:1.利用浸润于1mol/L Na OH溶液的单层滤纸片贴附于小鼠中央角膜10s,可建立深浅适度、可重复性强的小鼠角膜碱烧伤动物模型。2.角膜碱烧伤后球结膜下注射骨髓间充质干细胞和角膜碱烧伤后骨髓间充质干细胞培养上清液点眼,都具有促进角膜上皮修复的作用。造模后1天、3天、5天、7天,应用PBS点眼的对照组角膜上皮缺损面积大于另外两个治疗组,差异具有统计学意义。3.角膜碱烧伤后球结膜下注射骨髓间充质干细胞和角膜碱烧伤后骨髓间充质干细胞培养上清液点眼,两种治疗方法都在一定程度上具有减少角膜新生血管生成的作用。造模后3天、7天、14天、21天、28天,应用PBS点眼的对照组新生血管面积大于另外两个治疗组,差异具有统计学意义。4.角膜碱烧伤后球结膜下注射骨髓间充质干细胞和角膜碱烧伤后骨髓间充质干细胞培养上清液点眼,两种治疗方法都具有改善角膜混浊程度的作用。造模后3天、7天、14天、21天、28天,应用PBS点眼的对照组角膜混浊度评分大于另外两个治疗组。5.通过HE染色观察显示,与两个治疗组相比,PBS液点眼组角膜上皮愈合较慢,新生角膜上皮层数较少,基质细胞排列较紊乱,炎性细胞浸润和新生血管生成相对较多。而碱烧伤后28天两个治疗组角膜基质层胶原排列较规则,无炎性细胞浸润,新生血管较少。角膜基质细胞计数显示球结膜下注射骨髓间充质干细胞组和骨髓间充质干细胞培养上清液点眼组细胞数量低于PBS液点眼组,差异具有统计学意义。6.免疫组织化学检查显示,PBS点眼组角膜基质层的α-SMA和MMP-9表达阳性度较高,而该组在角膜上皮层基底细胞的Ki-67阳性度低于另外两组。结论:结膜下注射骨髓间充质干细胞和骨髓间充质干细胞培养上清液点眼两种方法都对碱烧伤后的小鼠角膜具有修复作用。局部应用的骨髓间充质干细胞和其培养上清液能够改善碱烧伤后角膜透明度,促进角膜上皮愈合并能够相对抑制角膜新生血管的形成。
苗莹[10]2013年在《基于脱细胞猪角膜基质的组织工程人角膜基质的体外重建及其动物移植研究》文中提出角膜位于眼球的最表面，因直接与外界接触故易受到损伤或感染，一旦受到损伤和发生病变，就会引起角膜混浊，造成视力的减退甚至丧失。角膜病是我国主要的致盲病之一，仅次于白内障，我国现有角膜病盲患者近500万人，而全世界现有角膜病盲患者近6000万人，其中大部分是由于角膜基质异常而引起的，而且还在逐年递增。角膜病尤其是角膜盲不仅给患者个人带来巨大的痛苦，在生活上还需要家人等的照顾，给家庭和社会带来了巨大的经济负担。目前，治疗角膜盲的唯一有效方法就是进行角膜移植，但由于角膜供体的严重短缺，无法满足现有众多角膜病盲患者治疗的需要。近年来，角膜组织工程技术的兴起使体外重建出组织工程人角膜成为可能，而体外重建的组织工程人角膜基质，作为捐献角膜的替代物，已成为众多角膜病盲患者通过角膜移植而复明的唯一希望。组织工程人角膜基质的体外重建急需解决足量种子细胞的来源和理想生物相容性载体支架的制备问题。本实验室通过多年研究，已建立了多个非转染人角膜基质细胞系，初步成功解决了种子细胞的来源问题，并初步建立了脱细胞猪角膜基质制备的技术工艺，本文拟在已有技术工艺的基础上，通过改进和优化利用猪角膜基质制备出脱细胞猪角膜基质，并利用本实验室业已建立的非转染人角膜基质细胞系细胞对其进行生物相容性研究，进而以脱细胞猪角膜基质为载体支架、以非转染人角膜基质细胞为种子细胞，开展组织工程人角膜基质的体外重建研究，并对体外重建所得组织工程人角膜基质的形态结构和功能蛋白表达进行鉴定，最后利用新西兰兔和比格犬的板层角膜基质移植进行生物学功能验证，评估组织工程人角膜基质作为捐献角膜替代物用于临床角膜移植的可行性。本文首先开展了脱细胞猪角膜基质的优化制备研究，采用脱氧胆酸钠-原钒酸钠混合液处理、反复冻融和DNA-RNA酶处理等技术工艺对猪角膜基质进行了脱细胞处理，制备出脱细胞猪角膜基质，在利用HE染色、冰冻切片的荧光染色以及透射电子显微镜技术对其形态结构进行鉴定的基础上，又对其透光性能及其孔隙率等理化性质进行了检测。鉴定结果显示，所得脱细胞猪角膜基质中胶原纤维排列规则、结构均匀而完整，没有明显细胞和核物质的残留，且透光性能好、机械性能好，与正常猪角膜无显着差异，表明本文制备所得脱细胞猪角膜基质符合作为组织工程人角膜基质载体支架的条件和要求，可用于组织工程人角膜基质的体外重建研究。在利用人角膜基质细胞检测脱细胞猪角膜基质的生物相容性之前，本文首先利用生长曲线、染色体标本制做和免疫细胞化学技术对第15代人角膜基质细胞的生长特性、核型、标志蛋白和功能蛋白的表达进行了检测和鉴定。检测和鉴定结果发现，第15代人角膜基质细胞的生长分裂状态良好，群体倍增时间为43.57h，其特征性染色体数目为46条，保持有波形蛋白（人角膜基质细胞标志性蛋白）的阳性表达，并具有细胞连接蛋白间隙连接蛋白-43和整联蛋白β1的阳性表达，以及膜运输载体蛋白——钠钾泵和钙泵及乙醛脱氢酶的阳性表达，证明第15代人角膜基质细胞具有正常人角膜基质细胞的属性和发挥正常细胞功能的潜能，符合作为组织工程人角膜基质种子细胞的条件和要求，可用于组织工程人角膜基质的体外重建研究。在获得脱细胞猪角膜基质和人角膜基质细胞的基础上，本文采用微量注射技术将第15代人角膜基质细胞接种到脱细胞猪角膜基质中，利用MTT法和免疫细胞化学技术对脱细胞猪角膜基质与人角膜基质细胞的生物相容性进行了鉴定研究。结果发现，脱细胞猪角膜基质载体支架的浸提液对第15代人角膜基质细胞没有细胞毒性，而接种至载体支架内的人角膜基质细胞在接种后1~5d内一直保持有波形蛋白以及间隙连接蛋白-43和整联蛋白β1的阳性表达，且在接种后第3d细胞的形态、分布和波形蛋白以及间隙连接蛋白-43和整联蛋白β1的表达已经十分理想，表明脱细胞猪角膜基质与人角膜基质细胞具有良好的生物相容性，可以用于组织工程人角膜基质的体外重建研究。在进行生物相容性研究的基础上，本文以脱细胞猪角膜基质为载体支架、以非转染第15代人角膜基质细胞为种子细胞，开展了组织工程人角膜基质的体外重建研究，并对所得组织工程人角膜基质的形态结构和功能蛋白表达进行鉴定。对于制备所得生物相容性良好的脱细胞猪角膜基质载体支架，利用微量注射技术接种第15代人角膜基质细胞，放置于含有10%胎牛血清-DMEM/F12培养液的24孔培养板孔中在37℃二氧化碳培养箱中体外培养3d，获得体外重建的组织工程人角膜基质。石蜡切片HE染色、免疫细胞化学、透射电镜等的鉴定结果显示，体外重建的组织工程人角膜基质的形态结构与活体人角膜相似，其种子细胞仍保持有波形蛋白、整联蛋白β1、间隙连接蛋白-43、乙醛脱氢酶、钠钾泵和钙泵的1阳性表达，表明体外重建的组织工程人角膜基质与活体人角膜基质不仅形态结构相似，还保持有执行人角膜基质功能的潜能。为了验证体外重建的组织工程人角膜基质是否具有正常的生物学功能，本文又选用新西兰兔和比格犬对组织工程人角膜基质进行了板层角膜基质移植实验，并利用裂隙灯显微镜、角膜测厚仪和眼压计对移植动物角膜的的透明度、角膜厚度和眼压进行了跟踪监测。结果表明，术后20d，新西兰兔术眼角膜保持透明，角膜无感染，无新生血管。利用石蜡切片HE染色、免疫细胞化学、透射电镜等技术对移植兔眼进行了离体鉴定，HE染色结果显示组织工程人角膜基质植片与植床愈合情况良好；荧光显微镜观察结果显示植片上有DiI标记的人角膜基质细胞定位，透射电镜结果显示重建的组织工程人角膜基质中胶原纤维排列紧密规则，人角膜基质细胞伸展其间，并且与支架形成了细胞连接。免疫荧光染色结果显示，标志蛋白-波形蛋白，功能蛋白-间隙连接蛋白-43、整联蛋白β1、钠钾泵、钙泵和乙醛脱氢酶的表达均呈阳性，说明人角膜基质细胞移植入体内后有发挥生物学功能的潜能。比格犬角膜移植实验结果表明，移植早期比格犬术眼角膜角膜轻微水肿，到一个月时，角膜逐渐透明，术后120d，比格犬术眼角膜保持透明，角膜无感染，无新生血管，至今仍在跟踪观察。移植眼角膜厚度和眼压与对照眼相比，无显着差异。上述动物移植结果表明，本文体外重建所得组织工程人角膜基质在植入动物眼上以后能发挥生物学功能，有望作为捐献角膜的替代物用于角膜基质病盲患者的临床角膜移植和治疗，动物移植实验的成功为临床实验研究奠定了基础。综上所述，本文首次利用改进的技术方法制备出脱细胞猪角膜基质，并利用属性和功能蛋白表达正常的非转染人角膜基质细胞对其进行了生物相容性研究，进而以脱细胞猪角膜基质为载体支架、以非转染人角膜基质细胞为种子细胞成功体外重建出了形态结构正常且生物学功能正常的组织工程人角膜基质，有望用作捐献角膜的等效替代物用于角膜基质病盲患者的临床角膜移植和治疗，为众多角膜基质病盲患者重见光明创造了条件。
参考文献：
[1]. 兔角膜内皮细胞移植和自体骨髓间充质干细胞替代移植治疗角膜内皮损伤的初步研究[D]. 刘小伟. 中国协和医科大学. 2004
[2]. 脐带间充质干细胞培养及体外重建角膜后板层的初步研究[D]. 陈义. 暨南大学. 2010
[3]. 骨髓间充质干细胞与脱细胞角膜基质构建组织工程角膜研究[D]. 姜河. 西北农林科技大学. 2008
[4]. 恒河猴骨髓间充质干细胞体内及体外诱导为角膜内皮细胞的研究[D]. 崔燕. 昆明医科大学. 2013
[5]. 以猪角膜板层为载体诱导人骨髓间充质干细胞治疗兔角膜损伤的初步研究[D]. 施文建. 暨南大学. 2010
[6]. 骨髓间充质干细胞移植促进兔角膜缘碱烧伤愈合机制的实验研究[D]. 乔丽萍. 天津医科大学. 2007
[7]. 兔自体骨髓间充质干细胞移植对角膜缘干细胞损伤的初步疗效研究[J]. 余锦强, 柯峰, 李儒华, 凌佼佼, 华远峰. 临床和实验医学杂志. 2014
[8]. 体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为角膜上皮细胞的初步研究[D]. 姜廷帅. 第四军医大学. 2007
[9]. 骨髓间充质干细胞及其培养上清液对小鼠角膜碱烧伤修复作用的实验研究[D]. 赵云. 天津医科大学. 2016
[10]. 基于脱细胞猪角膜基质的组织工程人角膜基质的体外重建及其动物移植研究[D]. 苗莹. 中国海洋大学. 2013
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