Leuconostoc citreum交替糖蔗糖酶异源表达、发酵优化及制备交替糖的研究

论文摘要

交替糖（alternan）包括交替糖多糖（polyalternan）和交替糖寡糖（oligoalternan）,含有交替连接的α-1,6糖苷键与α-1,3糖苷键,其独特的结构使其在医药、化妆品、饲料、保健、食品和印刷工业等各个领域具有广泛的用途。交替糖蔗糖酶（alternansucrase,EC 2.4.1.140）具有α-转糖苷活性,可以催化合成交替糖。本研究将Leuconostoc citreum CICC23234来源的交替糖蔗糖酶基因（asr）分别在Escherichia coli BL21和Bacillus subtilis WB600中异源表达,探究了两种宿主表达的重组酶的酶学性质,并选择了B.subtilis/pHY300PLK-asr重组菌进行发酵工艺研究,此外,探索了重组酶制备交替糖多糖和交替糖寡糖的工艺。主要研究结果如下:（1）构建了含有L.citreum CICC23234来源的asr基因的重组菌E.coli/pET24a-asr和B.subtilis/pHY300PLK-asr。摇瓶发酵两种重组菌,测得其胞外酶活分别为3.77 U mL-1和0.43 U mL-1。进一步考察两种重组酶的酶学性质,测得其最适pH均为6.0,最适温度均为45℃,在pH4.5-8.0下放置7天后,均能保持70%以上的残余酶活,此外,在40℃时的半衰期均在100 h以上。由于枯草芽孢杆菌为食品安全菌株,其分泌表达的重组酶具有更为广泛的应用范围,因此选择B.subtilis/pHY300PLK-asr重组菌进行进一步研究。（2）对重组菌B.subtilis/pHY300PLK-asr进行摇瓶优化,结果表明,重组菌的最适培养基成分为以25 g L-1大豆蛋白胨和25 g L-1玉米浆作为复合氮源,5 g L-1甘油作为碳源,培养温度为30℃,此时,重组交替糖蔗糖酶酶活力达到0.9 U mL-1。之后采取补料分批发酵的方式在3-L发酵罐中进行高密度培养,发酵82 h后,重组菌B.subtilis/pHY300PLK-asr的产酶水平达到最大值,为3.9 U mL-1,是摇瓶发酵优化后产酶能力的4.3倍。（3）通过凝胶渗透色谱、核磁共振和质谱等分析手段对重组酶酶反应产物进行鉴定,当以蔗糖为唯一底物时,产物交替糖多糖平均分子量Mw为1.9×106Da,聚合度DP为1.1×104,产物结构中α-1,6糖苷键与α-1,3糖苷键的含量分别为69%和31%。当以麦芽糖和曲二糖为受体时,产物仅为交替糖寡糖;当以葡萄糖和海藻糖为受体时,产物除了含有交替糖寡糖外,还含有大量的交替糖多糖。探究发现麦芽糖对交替糖蔗糖酶具有更高的亲和力,可以有效增加交替糖寡糖的得率,在后续制备交替糖寡糖的研究中选择麦芽糖作为受体分子。（4）分别探究了不同条件对重组交替糖蔗糖酶制备交替糖多糖和交替糖寡糖的影响,确定了最优的制备工艺如下:以150 g L-1蔗糖为底物,加酶量为2 U g-1,反应温度为40℃,反应pH为5.5,反应时间为20 h,此时,转化率最高可达到46.5%,交替糖多糖的产量为69.8 g L-1;以225 g L-1蔗糖和75 g L-1麦芽糖为底物,加酶量为2.5 U g-1,反应温度为40℃,反应pH为5.5,反应时间为24 h,此时,转化率最高可达到59.6%,交替糖寡糖的产量为178.8 g L-1。

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摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 交替糖的概述

1.1.1 交替糖的性质

1.1.2 交替糖的制备

1.1.3 交替糖的应用

1.2 交替糖蔗糖酶概述

1.2.1 交替糖蔗糖酶的来源与制备

1.2.2 交替糖蔗糖酶的性质与结构

1.2.3 交替糖蔗糖酶的反应机制

1.3 大肠杆菌和枯草芽孢表达系统的概述

1.3.1 大肠杆菌表达系统的简介

1.3.2 枯草芽孢杆菌表达系统的简介

1.4 立题依据及意义

1.5 本论文的研究内容

第二章材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种与质粒

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.2 分子生物学操作方法

2.2.1 目的基因的获取

2.2.2 目的基因与克隆载体18-T simple的连接

2.2.3 质粒DNA提取与限制性酶切

2.2.4 目的基因与表达载体pET24a的连接

2.2.5 目的基因与表达载体pHY300PLK的连接

2.2.6 E.coli感受态的制备

2.2.7 E.coli感受态的热激转化

2.2.8 B.subtilis感受态的制备

2.2.9 B.subtilis感受态的电转化

2.3 发酵方法

2.3.1 培养基

2.3.2 重组E.coli的摇瓶发酵

2.3.3 重组B.subtilis的摇瓶发酵

2.3.4 重组B.subtilis的3-L罐发酵

2.4 分析方法

2.4.1 菌浓的测定

2.4.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析

2.4.3 交替糖蔗糖酶酶活测定

2.4.4 重组酶的酶学性质的研究

2.4.5 交替糖的凝胶渗透色谱检测方法

2.4.6 交替糖的核磁共振分析方法

2.4.7 交替糖的质谱分析方法

2.4.8 交替糖的高效液相色谱检测方法

2.5 交替糖的酶转化工艺

2.5.1 交替糖多糖的制备工艺

2.5.2 交替糖寡糖的制备工艺

第三章结果与讨论

3.1 L.citreum交替糖蔗糖酶的克隆表达及酶学性质

3.1.1 L.citreum交替糖蔗糖酶基因的获取

3.1.2 L.citreum交替糖蔗糖酶在E.coli中的异源表达

3.1.3 L.citreum交替糖蔗糖酶在B.subtilis中的异源表达

3.1.4 L.citreum交替糖蔗糖酶的酶学性质研究

3.2 重组菌B.subtilis/pHY300PLK-asr发酵条件优化

3.2.1 重组菌B.subtilis/pHY300PLK-asr的摇瓶发酵优化

3.2.2 重组菌B.subtilis/pHY300PLK-asr的3-L罐发酵

3.3 重组交替糖蔗糖酶酶反应产物的鉴定

3.3.1 以蔗糖为唯一底物的重组酶酶反应的产物鉴定

3.3.2 以蔗糖和小分子糖为底物的重组酶酶反应的产物鉴定

3.4 重组交替糖蔗糖酶制备交替糖的条件优化

3.4.1 重组交替糖蔗糖酶制备交替糖多糖的条件优化

3.4.2 重组交替糖蔗糖酶制备交替糖寡糖的条件优化

主要结论与展望

主要结论

展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 朱洁

导师: 吴丹

关键词: 交替糖蔗糖酶,枯草芽孢杆菌,发酵优化,交替糖多糖,交替糖寡糖

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ925

总页数: 56

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Leuconostoc citreum交替糖蔗糖酶异源表达、发酵优化及制备交替糖的研究

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