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火龙果色素相关MYB基因的克隆及表达分析

2020-12-08阅读(887)

火龙果色素相关MYB基因的克隆及表达分析

论文摘要

MYB转录因子是一个成员庞大的超家族,具有功能多样性,广泛参与植物体生长发育、次级代谢调控及逆境应答等途径。近年来,关于MYB转录因子参与植物色素合成机制日益成为研究焦点,红肉火龙果果实中含有丰富的色素,在抗氧化和抗癌方面具有重要的作用,但针对转录因子MYB参与调控火龙果色素合成途径的研究报道较少,因此挖掘火龙果色素合成的关键基因,为更一步深入探索火龙果色素合成调控的分子机制奠定基础。在前期工作基础上,本文以火龙果不同发育时期的果实为材料,利用qRT-PCR技术,根据表达趋势筛选色素积累相关的MYB转录因子,并采用RACE法克隆色素积累相关的MYB转录因子基因（HuMYB1841）全长序列;为了进一步探索该基因的功能,构建了用于酵母单杂交表达的载体,对深入探究MYB参与火龙果色素代谢的关键基因,以及通过基因工程创制含有丰富色素的新种质均具有重要意义。主要研究结果如下:1、采用稳定性评估软件geNorm和NormFind并结合qRT-PCR方法,从17种候选内参基因中筛选出火龙果果实不同发育期的内参基因为TBP2与YLS8。2、通过qRT-PCR与转录组数据相结合的分析方式,从基因表达水平上阐述了4个MYB转录因子在火龙果果实不同发育时期时空性表达情况。MYB1841在红肉品种-紫红龙的果实发育过程中,其表达量呈现先上调再下调,并且在破色期（H2）表达量达到最高值,而在白肉品种-晶红龙果实中表达量极低或不表达,该结果与甜菜色素合成途径中的关键基因CYP450趋势相似;MYB1222与MYB1841表达趋势较一致,但表达丰度较低;MYB636和MYB1082在火龙果果实发育期中整体表达量不稳定,呈现波动趋势;因此,推测MYB1841基因可能与火龙果色素合成密切相关。3、利用RACE技术,克隆出MYB1841全长序列并命名为HuMYB1841,全长911 bp,ORF 639 bp,共编码212 aa;生物信息学分析表明,蛋白序列中具有MYB家族结构域,且属于R2R3类转录因子,HuMYB1841在MYB家族保守区域上同源性较高。4、采用PEG介导的电化学法,将构建的融合蛋白表达载体（pBWA（V）HS-HuMYB1841-GFP）与空载（pBWA（V）HS-GFP）转入到拟南芥原生质体中共培养,激光共聚焦显微镜下观察显示,HuMYB1841蛋白具有核定位信号,与生物信息学软件预测结果一致,此结果为进一步理解HuMYB1841基因功能提供了新信息。5、用常规PCR法克隆了参与甜菜色素合成途径的关键基因CYP450的启动子序列,序列长度为1547 bp,并用在线软件对启动子内主要调控元件进行预测,结果发现有多处MYB转录因子结合位点。6、为进一步探究基因HuMYB1841的功能,构建了用于酵母单杂交实验的诱饵载体（pAbAi-CYP450）和猎物载体（pGADT7-HuMYB1841）,此外成功构建了诱饵酵母菌株。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩写名词表
  • 第一章 绪论
  •   1.1 植物色素
  •     1.1.1 β-胡萝卜色素
  •     1.1.2 花青素
  •     1.1.3 叶绿素
  •     1.1.4 甜菜红色素
  •   1.2 甜菜色素研究进展
  •     1.2.1 甜菜色素的理化性质
  •     1.2.2 甜菜色素的功能与应用
  •     1.2.3 甜菜素的代谢累积机制
  •     1.2.4 火龙果甜菜素研究现状
  •   1.3 植物MYB转录因子研究进展
  •     1.3.1 植物MYB转录因子的结构特点
  •     1.3.2 植物MYB转录因子的进化
  •     1.3.3 植物MYB转录因子的功能
  •   1.4 本研究内容、目的及意义
  • 第二章 火龙果果实发育期内参基因及MYBs差异基因筛选
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 实验材料
  •     2.1.2 实验试剂
  •     2.1.3 实验主要仪器设备
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 植物总RNA提取
  •     2.2.2 第一链cDNA的合成
  •     2.2.3 火龙果发育期内参基因筛选
  •     2.2.4 差异基因筛选
  •   2.3 结果与分析
  •     2.3.1 总RNA提取及检测
  •     2.3.2 内参基因筛选
  •     2.3.3 差异基因荧光定量PCR
  •   2.4 讨论
  •     2.4.1 火龙果不同发育期内参基因稳定性评估
  •     2.4.2 MYB转录因子对色素调控的分析
  • 第三章 HuMYB1841 基因的克隆及亚细胞定位
  •   3.1 材料与方法
  •     3.1.1 实验材料
  •     3.1.2 实验试剂及仪器设备
  •     3.1.3 HuMYB1841 全长克隆
  •     3.1.4 HuMYB1841 基因生物信息学分析
  •     3.1.5 HuMYB1841 基因亚细胞定位
  •   3.2 结果与分析
  •     3.2.1 总RNA检测
  •     3.2.2 HuMYB1841 全长克隆
  •     3.2.3 HuMYB1841 基因生物信息学分析
  •     3.2.4 HuMYB1841 亚细胞定位分析
  •   3.3 讨论
  •     3.3.1 基因HuMYB1841 的克隆及时空表达分析
  •     3.3.2 基因HuMYB1841 的亚细胞定位分析
  • 第四章 火龙果CYP450 基因启动子的克隆及酵母单杂载体构建
  •   4.1 材料与方法
  •     4.1.1 实验材料及仪器设备
  •     4.1.2 火龙果CYP450 基因启动子的克隆及诱饵载体构建
  •     4.1.3 酵母猎物载体构建
  •     4.1.4 诱饵载体菌株构建
  •   4.2 结果与分析
  •     4.2.1 PCR目标片段的获得
  •     4.2.2 CYP450 基因启动子的全长序列克隆
  •     4.2.3 酵母单杂交载体构建
  •     4.2.4 诱饵载体菌株构建
  •   4.3 讨论
  • 第五章 结论与展望
  •   5.1 主要结论
  •   5.2 后期工作展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 崇慧影

    导师: 文晓鹏

    关键词: 火龙果,色素,转录因子,内参基因,基因克隆

    来源: 贵州大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,园艺

    单位: 贵州大学

    分类号: Q943.2;S667.9

    总页数: 92

    文件大小: 2765K

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