新型GABA定量方法的建立及短乳杆菌CD0817实时荧光定量PCR内参基因的筛选

论文摘要

γ-氨基丁酸（Gamma-Aminobutyric Acid,GABA）是天然存在的一种非蛋白质氨基酸,具有许多重要的生理学功能,是动植物体内主要的生物活性分子。由于乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）被认为是安全的且有较高的GABA生产能力,近年来许多研究都集中于用LAB作为细胞工厂生产GABA。本课题组前期筛选到一株高产GABA的短乳杆菌CD0817,了解该菌株的基因表达模式将有助于研究其对不同培养条件(如Mn2+胁迫)的适应性。然而,在短乳杆菌基因规范化表达研究中,对于筛选合适内参基因的研究却很少。基于此,本论文在不同胁迫条件下筛选出了合适的内参基因;此外,由于筛选内参基因的需要,本文还建立了一种新型且实用的GABA定量方法。主要结果如下。（1）建立了一种新型且高效的GABA定量分析方法。由于谷氨酸与GABA之间存在相互作用且该作用严重阻碍了两种化合物的分离。因此,我们提出了醋酸锌辅助差异沉淀/溶解（ZA-DPD）策略,通过逐步回收GABA以除去发酵液中的干扰物谷氨酸,这主要归因于两种重要试剂（谷氨酸沉淀试剂和谷氨酸排斥试剂）的使用。在每次沉淀过程中,谷氨酸沉淀试剂保证大部分GABA仍可溶,仅少量GABA与谷氨酸共沉淀;在耦合的溶解过程中,共沉淀的GABA完全溶出,仅少量（水为溶解剂）或无（谷氨酸排斥试剂为溶解剂）谷氨酸共溶出,这一过程重复两次,直到完全去除谷氨酸盐。随后建立了ZA-DPD—比色法定量GABA。该方法是将25μL的醋酸钠缓冲液（pH 5.8）加入到已去除谷氨酸的GABA发酵液样品（2 mL）中并混匀,然后加入0.2 mL的茚三酮显色剂并混匀,随后放于水浴锅中50℃显色50 min;之后测定吸光值,对样品中的GABA进行定量。该方法或许有助于与GABA或谷氨酸相关领域的研究。（2）为了准确可靠的进行基因表达分析,有必要使用一个或多个合适的内参基因对基因表达数据进行标准化。本实验中,我们采用geNorm、NormFinder、BestKeeper三种统计方法,对不同培养条件、不同生长阶段的10个候选基因（FUSA[translation elongation factor G],16s rRNA,HSP60[Chaperonin GroEL],LDHD[D-lactate dehydrogenase],PYRG[CTP synthase],RPOC[pyrroline-5-carboxylate reductase],RECA[RecA/RadA recombinase],PHES[Phenylalanine--tRNA ligase alpha subunit],GAPDH[Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase],TUF[Elongation factor Tu]）的表达水平和稳定性进行评估,以筛选出合适的内参基因。结果表明,在全部样本中,最佳的内参基因为RECA,其次是TUF和PHES;在Mn2+胁迫条件下,最佳的内参基因为RECA,其次是LDHD和TUF;在谷氨酸胁迫条件下,最佳的内参基因为TUF,其次是PHES和RECA。本实验将为进一步研究CD0817等乳酸菌（LAB）在锰离子或谷氨酸条件下目的基因的表达分析进行标准化校正,同时也为其它乳酸菌内参基因的选择提供依据。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第1章绪论

1.1 γ-氨基丁酸

1.1.1 γ-氨基丁酸简介

1.1.2 GABA的应用

1.1.3 GABA的代谢途径

1.1.4 GABA的制备

1.1.4.1 植物富集法

1.1.4.2 化学合成法

1.1.4.3 微生物发酵法

1.2 乳酸杆菌

1.3 基因表达量的测定方法

1.4 实时荧光定量PCR技术

1.4.1 实时荧光定量PCR的基本原理

1.4.2 qPCR中的荧光化学物质

1.4.3 qPCR的定量方法

1.4.3.1 绝对定量

1.4.3.2 相对定量

1.5 内参基因

1.5.1 内参基因筛选的必要性

1.5.2 理想的内参基因应具备的条件

1.5.3 候选内参基因的稳定性分析

1.6 研究内容与意义

1.6.1 研究内容

1.6.2 研究意义

第2章醋酸锌辅助差异沉淀/溶解法分离谷氨酸和GABA:用于定量发酵性GABA

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.1.1 实验仪器

2.2.1.2 实验试剂和材料

2.2.1.3 培养基

2.2.1.4 试剂的配制

2.2.2 实验方法

2.2.2.1 GABA发酵液的制备

2.2.2.2 预染纸色谱方法

2.2.2.3 除去发酵液中的谷氨酸

2.2.2.4 比色法定量发酵液中的GABA

2.2.2.5 HPLC

2.2.2.6 统计学分析

2.3 结果与讨论

2.3.1 从氨基酸混合液中去除谷氨酸

2.3.1.1 用氨基酸纯溶液初步筛选谷氨酸沉淀溶剂

2.3.1.2 用氨基酸混合溶液二次筛选谷氨酸沉淀溶剂

2.3.1.3 金属盐有助于从氨基酸混合液中沉淀谷氨酸

2.3.1.4 从GABA发酵液中沉淀谷氨酸

2.3.2 比色法定量发酵液中的GABA

2.3.2.1 GABA-茚三酮显色反应的优化

2.3.2.2 GABA的色谱基定量方法

2.4 本章小结

第3章短乳杆菌CD0817 实时荧光定量PCR内参基因筛选

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.1.1 实验仪器

3.2.1.2 实验试剂和材料

3.2.1.3 培养基

3.2.1.4 试剂的配制

3.2.2 实验方法

3.2.1.1 发酵和培养条件

3.2.1.2 RNA提取和质量评估

3.2.1.3 RNA反转录成cDNA

3.2.1.4 引物设计和扩增效率评估

3.2.1.5 实时荧光定量PCR

3.2.1.6 候选内参基因的稳定性分析

3.2.1.7 不同实验条件下GABA的定量分析方法

3.3 结果与讨论

3.3.0 RNA质量评估

3.3.1 引物扩增效率及产物特异性评估

3.3.2 候选内参基因的转录普分析

3.3.3 候选内参基因的表达稳定性分析

3.3.3.1 geNorm分析

3.3.3.2 NormFinder分析

3.3.3.3 BestKeeper分析

3.3.4 不同实验条件下GABA的定量分析

3.4 本章小结

第4章总结与展望

4.1 总结

4.2 创新点

4.3 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈圆洪

导师: 王水兴,李海星

关键词: 短乳杆菌,氨基丁酸,醋酸锌,差异沉淀,溶解,比色法,内参基因,实时荧光定量,胁迫,谷氨酸胁迫

来源: 南昌大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 南昌大学

分类号: Q51;Q78

DOI: 10.27232/d.cnki.gnchu.2019.000275

总页数: 71

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