首页> 正文

多重刺激响应性聚合物前药的构建用于共载抗肿瘤药物和p53基因

2020-12-02阅读(237)

多重刺激响应性聚合物前药的构建用于共载抗肿瘤药物和p53基因

论文摘要

目前,多功能刺激响应性聚合物材料已被广泛应用于药物载体和基因载体递送体系。这是由于在人体内不同组织以及细胞内pH值和谷胱甘肽浓度具有差异性,例如血液及正常组织部位的pH值约为7.4,而肿瘤细胞中核内体和溶酶体的pH为4.5～6.5;此外,肿瘤组织和肿瘤细胞内部的谷胱甘肽浓度几乎可以达到正常组织的1000倍以上;这就为构建pH和还原响应性药物载体提供了先决条件,能够实现在肿瘤细胞内快速响应,释放出原药,从而抑制癌细胞的增殖。因此,构建多重刺激响应性聚合物前药在治疗癌症方面具有较好的应用前景。而药物与基因组合治疗不仅能够避免耐药性,还能有效地提高基因和药物的生物利用率,减少化疗药物的系统毒性和剂量,从而降低患者的痛苦。本论文采用开环聚合（ROP）、原子转移自由基聚合（ATRP）、可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合以及“点击”化学联用的方法,制备具有pH/还原双响应性的壳交联聚合物前药、叶酸靶向和pH响应性的聚两性离子前药用于治疗癌症;设计出高效率药物和基因载体,用于实现药物和基因的组合治疗。本论文的研究内容主要分为以下四个部分:（1）一锅法制备pH/还原响应性聚合物前药以及构建壳交联聚合物前药纳米粒子用于药物传递的研究。本文报道了一种新型pH/还原响应性动态共价壳交联胶束,该胶束是由一种多功能聚合物前药自组装而形成。首先,由开环聚合制备大分子引发剂PBYP-ss-iBuBr,其中,BYP代表2-炔丁氧基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷。随后,将ATRP和Cu（I）催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）相结合,以甲基丙烯酸二甲氨乙酯（DMAEMA）、2-甲基丙烯酸酯-4-对醛基苯甲酸羟乙酯（FBEMA）以及含叠氮基的阿霉素衍生物（DOX-hyd-N3）为反应原料,通过一锅法得到PBYP-hyd-DOX-ss-P（DMAEMA-co-FBEMA）聚合物前药。对聚合物前驱体和聚合物前药的化学结构进行了充分表征。在自组装形成的聚合物前药纳米粒子中加入二硫代丙二酰肼（DTP）,形成壳交联聚合物前药胶束（SCL）。与未交联的聚合物前药胶束相比,SCL前药胶束能增强稳定性,防止药物在血液循环过程中发生泄漏。利用动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）分别对SCL前药胶束的平均粒径和形貌进行检测。SCL前药胶束在偏酸性和/或还原性微环境下会发生解离,即在肿瘤内涵体/溶酶体的pH介质或高GSH介质中发生解离。通过DOX控制释放实验也证明了 SCL前药胶束具有pH/还原响应性。细胞毒性和细胞内吞实验揭示了 SCL前药胶束可通过内吞作用迅速进入到肿瘤细胞中,在细胞内能够释放DOX,有效抑制细胞增殖。本研究为制备多功能抗肿瘤聚合物前药提供了一种快速、高效的合成方法,所制备的聚合物前药对于治疗肿瘤具有良好的应用前景。（2）叶酸靶向和pH响应性的两性离子屏蔽聚合物前药用于药物载体。采用RAFT聚合、席夫碱反应以及点击化学反应相结合,利用DOX分子结构中的氨基官能团与P（MPC-co-PEGMA-BZ）聚合物侧链的醛基反应,合成了叶酸靶向的聚合物前药,缩写为 FA-P（MPC-co-PEGMA-BZ）-g-DOX。其中,MPC 和 PEGMA-BZ 分别是 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯。聚合物前药能够在水溶液中自组装成纳米粒子。采用DLS和TEM分别对聚合物前药纳米粒子的平均粒径和形貌进行检测。我们还对其体外控制释放行为进行研究,在弱酸性微环境下,聚合物前药纳米粒子能够发生快速解离并释放出药物。利用MTT实验证明,P（MPC-co-PEGMA-BZ）共聚物具有良好的生物相容性,FA-P（MPC-co-PEGMA-BZ）-g-DOX前药纳米粒子比没有叶酸靶向的聚合物前药纳米粒子具有更高的细胞摄取率。进一步利用细胞毒性和内吞实验证明,由于多价磷酸化胆碱（PC）基团与细胞膜具有强烈相互作用,FA-P（MPC-co-PEGMA-BZ）-g-DOX前药纳米粒子能够在HeLa细胞表面富集并快速被内吞进去。这类具有靶向和pH响应性的多功能聚合物前药纳米粒子,在肿瘤化疗方面显示出良好的应用潜力。（3）基于聚甲基丙烯酸缩水甘油酯构建高效基因载体。首先,我们利用RAFT聚合制备聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）,然后利用其分别与乙醇胺（EA）、异丙醇胺（AP）和N-羟乙基乙二胺（HA）进行开环反应,得到三种侧链含有羟基和胺基的聚甲基丙烯酸酯类基因载体,分别简写为PGEA、PGAP和PGHA。利用核磁共振氢谱（1HNMR）、凝胶渗透色谱（GPC）、X射线光电子能谱（XPS）以及傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对合成的三种聚合物的化学结构以及元素含量进行表征。随后,三种聚合物能够在水中完全溶解,与基因完全复合,形成聚合物/基因复合物;通过凝胶阻滞电泳对不同氮磷比的聚合物/基因复合物压缩基因的能力以及复合物在负电荷环境下的稳定性进行验证。与此同时,采用细胞毒性测试和活细胞工作站对不同浓度的聚合物以及不同氮磷比的聚合物/基因复合物进行生物学性能评价。结果表明,所设计的三种阳离子聚合物具有较好的生物相容性,聚合物/基因具有较好的细胞转染效率和抑制肺癌细胞增殖的能力,而PGHA/p53复合物的转染效率要比其余两种聚合物/基因复合物的转染效率要高。因此,初步实验结果可以表明所构建的阳离子聚合物作为基因载体具有广阔的应用前景。（4）阳离子共聚物PCL-ss-P（GHA-co-PEGMA）用于共载阿霉素和p53基因。首先,利用ROP和RAFT相结合,制备出PCL-ss-P（GMA-co-PEGMA）聚合物;然后,利用N-羟乙基乙二胺（HA）对聚合物侧链的环氧基团进行开环反应,得到PCL-ss-P（GHA-co-PEGMA）阳离子聚合物。利用1H NMR、GPC 和 XPS 对 CPDB-ss-OH、P（GMA-co-PEGMA）以及PCL-ss-P（GHA-co-PEGMA）的化学结构、分子量分布以及元素含量进行表征。聚合物PCL-ss-P（GHA-co-PEGMA）（简写为PGHAP）能够自组装形成纳米粒子,并且能够包载DOX和压缩p53基因,形成DOX负载PCL-ss-P（GHA-co-PEGMA）/p53复合物（简写为DPGHAP/p53）。凝胶阻滞电泳实验结果表明,DPGHAP/p53复合物可以很好地固定基因,并且在负电荷的条件下,能够维持复合物的稳定性。细胞毒性实验结果表明,与单独使用游离药物或/和游离基因治疗相比,DPGHAP/p53复合物对A549和H1299细胞具有明显的抗肿瘤作用。激光共聚焦显微镜结果显示,DPGHAP/p53复合物能有效地将DOX和p53基因传递并释放到A549细胞中。因此,所构建的阳离子聚合物可以作为抗癌药物和基因载体具有较好的应用前景。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 本论文选题目的及意义
  •   1.2 刺激响应性药物载体
  •     1.2.1 酸敏感性药物载体
  •     1.2.2 还原敏感性药物载体
  •     1.2.3 多重刺激响应性聚合物载体
  •   1.3 刺激响应性聚合物载体的制备方法
  •     1.3.1 开环聚合物反应
  •     1.3.2 原子转移自由基聚合
  •     1.3.3 可逆加成-断裂链转移聚合
  •     1.3.4 “点击”化学反应
  •     1.3.5 可控/“活性”聚合以及点击反应联用在生物医用材料中的应用
  •   1.4 生物医用高分子材料
  •     1.4.1 聚磷酸酯（PPEs）的概述
  •     1.4.2 聚己内酯（PCL）的概述
  •     1.4.3 两性离子聚合物的概述
  •   1.5 靶向分子简介
  •   1.6 基因与药物组合治疗
  •     1.6.1 p53抑癌基因
  •     1.6.2 基因载体
  •   1.7 构建刺激响应性聚合物药物载体交联体系
  •   1.8 参考文献
  • 第二章 一锅法制备pH/还原性聚合物前药以及构建壳交联聚合物前药纳米粒子用于药物传递的研究
  •   2.1 引言
  •   2.2 原料与试剂
  •   2.3 实验部分
  •     2.3.1 二硫代丙二酰肼（DTP）的合成
  •     2.3.2 2-甲基丙烯酸酯-4-对醛基苯甲酸羟乙酯（FBMEA）的合成
  •     2.3.3 HO-ss-iBuBr双头试剂的合成
  •     2.3.4 PBYP-ss-iBuBr大分子引发剂
  •     2.3.5 一锅法合成PBYP-hyd-DOX-ss-P（DMAEMA-co-FBEMA）聚合物前药
  •     2.3.6 聚合物前药自组装行为研究
  •     2.3.7 壳交联聚合物前药纳米粒子的制备
  •     2.3.8 聚合物前药纳米粒子的体外药物释放行为研究
  •     2.3.9 纳米药物载体的体外细胞毒性研究
  •     2.3.10 细胞内吞实验
  •   2.4 测试和表征
  •     2.4.1 核磁共振波谱（NMR）
  •     2.4.2 凝胶渗透色谱（GPC）
  •     2.4.3 高效液相色谱（HPLC）
  •     2.4.4 紫外光谱（UV-vis）
  •     2.4.5 透射电镜（TEM）
  •     2.4.6 动态激光光散射（DLS）
  •     2.4.7 酶标仪
  •     2.4.8 活细胞工作站
  •   2.5 结果与讨论
  •     2.5.1 二硫代丙二酰肼（DTP）的化学结构表征
  •     2.5.2 2-甲基丙烯酸酯-4-对醛基苯甲酸羟乙酯（FBMEA）、HO-ss-iBuBr及PBYP-ss-iBuBr的化学结构表征
  • 3的化学结构表征'>    2.5.3 阿霉素衍生物DOX-hyd-N3的化学结构表征
  •     2.5.4 PBYP-hyd-DOX-ss-P（DMAEMA-co-FBEMA）聚合物前药的表征
  •     2.5.5 聚合物前药的自组装行为研究
  •     2.5.6 聚合物前药DPD纳米粒子的体外药物释放研究
  •     2.5.7 聚合物前药纳米粒子的细胞毒性实验
  •     2.5.8 聚合物前药SCL-DPD纳米粒子的细胞内吞实验
  •   2.6 本章小结
  •   2.7 参考文献
  • 第三章 叶酸靶向的两性离子屏蔽聚合物前药的制备及用于pH响应性药物载体
  •   3.1 引言
  •   3.2 原料与试剂
  •   3.3 实验部分
  •     3.3.1 PEGMA-BZ单体的合成
  •     3.3.2 P（MPC-co-PEGMABZ）无规共聚物的合成
  •     3.3.3 P(MPC-co-PEGMABZ-g-DOX聚合物前药的合成
  •     3.3.4 炔丙基叶酸的合成
  •     3.3.5 叶酸靶向FA-P(MPC-co-PEGMABZ-g-DOX聚合物前药的合成
  •     3.3.6 P（MPC-co-PEGMA-BZ）-g-DOX聚合物前药自组装行为的研究
  •     3.3.7 采用直接溶解法制备聚合物前药纳米粒子
  •     3.3.8 聚合物前药中阿霉素含量以及阿霉素的体外药物释放
  •     3.3.9 聚合物前药纳米粒子抑制肿瘤细胞增殖性能测试
  •     3.3.10 细胞内吞测试
  •     3.3.11 细胞流式分析
  •   3.4 测试和表征
  •     3.4.1 核磁共振波谱（NMR）
  •     3.4.2 水相-凝胶渗透色谱（水相-GPC）
  •     3.4.3 高效液相色谱（HPLC）
  •     3.4.4 紫外光谱（UV-vis）
  •     3.4.5 透射电镜（TEM）
  •     3.4.6 动态激光光散射（DLS）
  •     3.4.7 酶标仪
  •     3.4.8 活细胞工作站
  •   3.5 结果与讨论
  •     3.5.1 PEGMA-BZ和CEP的化学结构表征
  •     3.5.2 P（MPC-co-PEGMA-BZ）无规共聚物的化学结构表征
  •     3.5.3 炔丙基叶酸和P（MPC-co-PEGMA-BZ）-g-DOX前药的化学结构表征
  •     3.5.4 FA-P（MPC-co-PEGMA-BZ）-g-DOX前药的化学结构表征
  •     3.5.5 聚合物前药的自组装行为研究
  •     3.5.6 聚合物前药FA-PMPD1纳米粒子的体外药物释放研究
  •     3.5.7 聚合物前药纳米粒子的细胞毒性实验
  •     3.5.8 聚合物前药PMPD1和FA-PMPD1纳米粒子的细胞内吞实验
  •     3.5.9 聚合物前药PMPD1和FA-PMPD1纳米粒子的流式细胞术研究
  •   3.6 本章小结
  •   3.7 参考文献
  • 第四章 基于甲基丙烯酸缩水甘油酯构建高效基因载体
  •   4.1 引言
  •   4.2 原料与试剂
  •   4.3 实验部分
  •     4.3.1 聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）的合成
  •     4.3.2 N-羟乙基乙二胺修饰的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGHA）的合成
  •     4.3.3 聚合物/基因复合物的Zeta电位和凝胶阻滞电泳实验
  •     4.3.4 阳离子聚合物的生物相容性及聚合物/p53复合物体外细胞毒性研究
  •     4.3.5 阳离子聚合物PGEA、PGAP和PGHA运载基因能力的表征
  •   4.4 测试与表征
  •     4.4.1 核磁共振波谱（NMR）
  •     4.4.2 凝胶渗透色谱（GPC）
  •     4.4.3 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）
  •     4.4.4 酶标仪
  •     4.4.5 活细胞工作站
  •   4.5 结果与讨论
  •     4.5.1 聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）的化学结构表征
  •     4.5.2 聚合物PGEA、PGAP以及PGHA的化学结构表征
  •     4.5.3 PGEA、PGAP及PGHA溶液的Zeta电位和生物相容性测试
  •     4.5.4 PGEA/DNA、PGAP/DNA、PGHA/DNA及PEI/DNA的Zeta电位
  •     4.5.5 PGEA/DNA、PGAP/DNA、PGHA/DNA及PEI/DNA的复合作用
  •     4.5.6 PGEA/DNA、PGAP/DNA、PGHA/DNA及PEI/DNA的稳定性
  •     4.5.7 PGEA、PGAP及PGHA阳离子载体运载p53-GFP能力的表征
  •     4.5.8 PGEA/p53-GFP、PGAP/p53-GFP及PGHA/p53-GFP的细胞毒性
  •   4.6 本章小结
  •   4.7 参考文献
  • 第五章 阳离子聚合物PCL-ss-P（GHA-co-PEGMA）用于共载DOX和p53基因
  •   5.1 引言
  •   5.2 原料与试剂
  •   5.3 实验部分
  •     5.3.1 4-CPDB-ss-OH的合成
  •     5.3.2 4-CPDB-ss-PCL均聚物的合成
  •     5.3.3 PCL-ss-P（GMA-co-PEGMA）共聚物的合成
  •     5.3.4 PCL-ss-P（GHA-co-PEGMA）共聚物的合成
  •     5.3.5 PCL-ss-P（GHA-co-PEGMA）共聚物的自组装行为研究
  •     5.3.6 载药PGHAP聚合物纳米粒子的体外药物释放
  •     5.3.7 载药DPGHAP/基因复合物的Zeta电位和凝胶阻滞电泳实验
  •     5.3.8 PHGAP的生物相容性及DPHGAP/p53基因复合物的细胞毒性
  •     5.3.9 共载阿霉素和p53基因的PHGAP纳米粒子内吞行为研究
  •   5.4 测试与表征
  •     5.4.1 核磁共振波谱（NMR）
  •     5.4.2 凝胶渗透色谱（GPC）
  •     5.4.3 酶标仪
  •     5.4.4 活细胞工作站
  •   5.5 结果与讨论
  •     5.5.1 PCL-ss-P（GHA-co-PEGMA）阳离子共聚物的结构表征
  •     5.5.2 PCL-ss-P（GHA-co-PEGMA）阳离子共聚物的自组装行为研究
  •     5.5.3 PGHAP、DPGHAP纳米粒子及DPGHAP/DNA的Zeta电位测试
  •     5.5.4 凝胶阻滞电泳实验-DPGHAP/DNA复合物的复合作用以及稳定性
  •     5.5.5 载药DPGHAP纳米粒子的体外药物释放研究
  •     5.5.6 聚合物PGHAP的体外细胞毒性实验
  •   5.6 本章小结
  •   5.7 参考文献
  • 第六章 全文总结与展望
  •   6.1 全文总结
  •   6.2 创新点
  •   6.3 存在的问题与展望
  • 攻读学位期间发表论文、申请专利及获奖情况
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 李磊

    导师: 倪沛红

    关键词: 聚合物前药,可控,活性聚合,刺激响应性聚合物,两性离子聚合物,基因载体

    来源: 苏州大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,生物学,有机化工

    单位: 苏州大学

    基金: 2017年江苏省普通高校研究生科研创新计划项目:合成多重响应性聚合物前药及协同治疗癌症的研究(KYCX17_1981),国家自然基金(21374066),江苏省自然科学基金(BK20171212),江苏省高校自然科学研究重大项目(15KJA150007)

    分类号: Q943;TQ460.1

    DOI: 10.27351/d.cnki.gszhu.2019.002799

    总页数: 203

    文件大小: 16888K

    下载量: 80

    相关论文文献

    • [1].不同级别宫颈上皮内瘤变与人乳头状瘤病毒感染及p53蛋白表达的相关性[J]. 延边大学医学学报 2019(03)
    • [2].云南汉族非综合征性唇腭裂与p53基因多态性的相关性研究[J]. 中国美容医学 2020(04)
    • [3].p53突变与结肠癌的研究进展[J]. 岳阳职业技术学院学报 2020(02)
    • [4].Ki-67、p53的表达水平在不同分子分型的乳腺浸润性导管癌中的临床意义[J]. 实用癌症杂志 2020(07)
    • [5].头颈部鳞状细胞癌中与p53突变相关基因的鉴定[J]. 现代肿瘤医学 2020(17)
    • [6].p53和Ki-67与子宫内膜癌患者临床病理特征的关系研究[J]. 当代医学 2020(21)
    • [7].老年非小细胞肺癌化疗患者p53及VEGF水平与生存状况的相关性[J]. 中国老年学杂志 2020(15)
    • [8].p53基因家族与甲状腺癌的相关研究进展[J]. 中国普外基础与临床杂志 2019(11)
    • [9].检测p53蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达及意义[J]. 中外医学研究 2019(31)
    • [10].p53与消化系统恶性肿瘤的研究进展[J]. 实用肿瘤学杂志 2016(05)
    • [11].胰岛素受体酪氨酸激酶底物p53蛋白在上皮性卵巢癌中的表达及其对患者预后的影响[J]. 肿瘤防治研究 2017(04)
    • [12].子宫内膜癌中P53、Ki-67和CA125的表达[J]. 肿瘤基础与临床 2017(01)
    • [13].P53和Ki-67在喉鳞状细胞癌中的表达及与短期预后的关系[J]. 临床与病理杂志 2017(03)
    • [14].p53在胶质瘤中的研究进展[J]. 海南医学 2017(08)
    • [15].p53免疫组化判定肾母细胞瘤预后的研究[J]. 临床小儿外科杂志 2016(02)
    • [16].抑癌基因p53、PTEN与子宫内膜癌预后相关性分析[J]. 河南科技大学学报(医学版) 2017(02)
    • [17].Bcl-2,Cox-2,HSPs和p53在骨肉瘤患者中的表达及临床意义[J]. 临床与病理杂志 2017(06)
    • [18].VEGF、P53的表达与食管癌临床特征及预后的关系[J]. 河北医药 2017(12)
    • [19].P53在肿瘤微环境、细胞代谢中的调控机制及检测技术的研究进展[J]. 临床检验杂志 2017(08)
    • [20].p53和鼠双微粒体2在肾母细胞瘤中的表达[J]. 中华实用诊断与治疗杂志 2016(02)
    • [21].黄芪多糖注射液联合吉非替尼对肺癌患者组织P53及Ki-67蛋白表达的影响[J]. 中国生化药物杂志 2016(03)
    • [22].p53和Ki-67表达在乳腺癌中的临床意义[J]. 国际检验医学杂志 2016(05)
    • [23].乳腺浸润性导管癌X线征象与Ki-67、p53表达的关系及临床意义[J]. 解放军医学院学报 2016(04)
    • [24].P53蛋白表达与晚期卵巢浆液性腺癌预后的相关性[J]. 中国医学科学院学报 2016(02)
    • [25].p53与胃肠道恶性肿瘤相关性的研究进展[J]. 中国中西医结合消化杂志 2016(04)
    • [26].胸腺瘤组织中P53、Ki-67、VEGF表达的相关性[J]. 临床和实验医学杂志 2016(11)
    • [27].p53蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达及意义探究[J]. 中国实用医药 2016(18)
    • [28].P53在结节性甲状腺肿合并甲状腺癌中的表达及其相关性研究[J]. 实用癌症杂志 2016(10)
    • [29].PTEN和P53蛋白与子宫内膜癌发生发展的相关性研究[J]. 临床和实验医学杂志 2016(21)
    • [30].COX-2、P53在胃癌组织中表达的意义[J]. 临床合理用药杂志 2014(34)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  ;  

    多重刺激响应性聚合物前药的构建用于共载抗肿瘤药物和p53基因
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕论降 版权所有 鄂ICP备12018319号-6