沈德新[1]2004年在《NICU常见致病菌寡核苷酸阵列检测方法的研究》文中指出[目的] 细菌感染是新生儿重症监护病房(Neonatal intensive care unit NICU)致病性和致死性的重要因素。目前诊断致病菌的方法，主要是在细菌培养和分离病原菌基础上依据血清学、形态和生化鉴定进行诊断。这种方法最大的弊端是培养和鉴定细菌耗时长，无法及时为临床提供抗生素选择依据，而盲目应用不恰当的抗生素可造成病原菌抗性积累。更有甚者，一些苛养菌难以培养或者不能被培养出来，根本无法提供病原菌信息。因此，早期、快速、简便、敏感地检测临床致病菌，是目前亟待解决的问题。本课题拟以16SrDNA为研究对象，旨在建立快速检测多种临床致病菌的寡核苷酸阵列方法。 [方法] 通过对83种常见细菌的16SrDNA序列比较分析，找出一段两端高度保守、中间相对变异的序列。依据其保守序列设计一对通用引物，用于扩增细菌16SrDNA目的序列。依据相对变异区域的序列设计常见的12种病原细菌的特异性探针，阵列于带正电或负电的尼龙膜上，与通用引物的PCR产物杂交，以判断样本中有无待检病原细菌及其种类。 同时探索探针固定的最佳方法，优化PCR反应条件及寡核苷酸阵列杂交条件，改进杂交液的配制，以提高寡核苷酸阵列杂交的灵敏度、特异性和杂交效率。 采用45株标准菌及123株野生菌对寡核苷酸阵列进行真实性、可靠性及价值评价，其指标包括：灵敏度、特异度、Youden指数、似然比、预测值等。 收集568份各类临床样本，比较传统细菌培养和寡核苷酸阵列检测方法对12种致病菌检出率的差异。 采用配对计数资料的卡方检验及Kappa系数检验进行统计学处理。 [结果] 建立了以16SrDNA为对象的寡核苷酸阵列检测方法。设计的通用引物能有效扩增出常见的细菌目的序列;寡核普酸阵列应用于12种NICU常见致病菌的检测，均能特异地与其检测细菌的通用引物PCR产物杂交，说明探针具有很强的特异性。寡核普酸阵列检出DNA灵敏度高，检出底限为IPg/林1。 通过对寡核普酸阵列建立方法的优化筛选发现:化学固膜法优于加尾加紫外交联法;改进后的杂交液与传统杂交液相比使杂交时间由6h缩短为30min;杂交温度控制在42℃一45℃之间杂交效果最佳。探针点膜浓度以4pmol一1 OPmol最为实用;预杂交与否均在尼龙膜上表现出较清晰的背景，不预杂交更为合适。 对寡核营酸阵列检测方法进行评价，阵列法检测165株菌的灵敏度为96.1%，特异度为95.0%，Youden指数为0.91，阳性似然比为19.22，阴性似然比为0.04，阳性预测值为98.4%，阴性预测值为88.4%。与细菌培养检测结果比较无显着性差异(P=0 .453)，两种方法吻合度良好 (k)0 .7)。 采用寡核普酸阵列和传统细菌培养方法分别检测568份临床样品，结果显示:对于易养菌的感染，两种方法检测的灵敏度相近，吻合程度良好(k>0 .7);对于苛养菌感染，寡核普酸阵列检出率明显高于传统细菌培养方法，二者具有显着性差异(P<0 .05)。 〔结论〕以16SrDNA为对象的寡核昔酸阵列具有较好的种属鉴定能力。可以简便、快速、特异地检测N工CU常见的12种致病菌。从接到样品到判读出结果，整个过程大约需要6h。寡核普酸阵列是快速诊断NICU常见感染病原菌的有效方法，适合临床检测的推广。
谢露露[2]2017年在《高通量核酸分析技术在新生儿肺炎病原体检测中的应用》文中研究表明目的通过泛病原体基因芯片和16S rRNA基因高通量测序这两种高通量核酸分析方法研究新生儿肺炎的病原体。材料和方法1.研究对象:选择2015年12月至2016年04月因新生儿肺炎在我院新生儿科住院治疗的患儿作为研究对象。收集的标本为气管内吸引物,气管内吸引物取样操作为:在气管插管状态下无菌吸痰操作吸取气管内吸引物0.5ml-1ml放于无菌管内。样本保存在-80℃的冰箱里,待实验用时取出并进行病原体核酸的提取。对于符合入选标准的患儿收集其相应的临床信息及病原学检查结果。2.泛病原体基因芯片实验:将样本进行预处理后提取核酸,提取核酸后进行泛病原体基因芯片实验。使用双激光扫描仪器对芯片进行扫描,用Feature Extraction软件进行原始数据读取,将荧光信号转变成数据。打开EOPM软件的网页,将原始微阵列数据导入EOPM软件中,得到病原体富集的统计信息。对获得数据进行分析并完成PCR鉴定。3.16S rRNA基因高通量测序实验:以16S rRNA基因的V3-V4区域为目标进行引物设计。引物是围绕着V3和V4区域周围的保守区来设计的。16S rRNA基因测序使用高可变区的PCR扩增产物建立数据库,文库构建步骤遵循Illumina测序仪文库构建方法。对16S rRNA基因测序所得的数据进行生物信息学分析:OTU聚类分析;Alpha多样性分析;用RDP数据库和Greengenes的数据库资源做物种分类及注释,进行物种分类统计。结果1.病例入选情况及临床病原学信息:本次研究收集24份气管内吸引物样本进行实验,共22名患儿。另外收集1份阴性对照样本。这22名患儿均诊断为新生儿肺炎。有13份样本临床病原学检查阳性,阳性率为54.2%,其中11份为细菌学培养阳性,2份为呼吸道合胞病毒阳性,呼吸道合胞病毒检查结果由PCR方法获得。2.泛病原体基因芯片结果:芯片显示4份样本呼吸道合胞病毒阳性,其最强的Cy5/Cy3比值分别为74.4、60.8、72.4、11.5,P值均<0.01。有4份样本提示细菌阳性,其中2例识别结果为链球菌属,最强的Cy5/Cy3比值分别为31.6、9.1,P值均<0.01。1份识别结果为芽胞杆菌属,最强的Cy5/Cy3比值为39.9,P值<0.01。1份不能识别出是何种属的细菌。1份样本提示真菌阳性,但是芯片未能识别是何种属真菌。4份样本的呼吸道合胞病毒的PCR均出现目标阳性条带,产物经测序比对确认为呼吸道合胞病毒序列。3.OTU聚类统计和Alpha多样性指数分析:24份样本的OTU平均数为797(47-2524),序列平均数为10624(144-34392)。24份样本的Shannon指数平均值为4.0(0.99-7.58),Simpson指数的平均值为0.71(0.19-0.99)。稀释曲线图提示当tags数增加到一定时,OTU的数目渐渐达到饱和,曲线趋向于平缓或者达到平台期,代表测序深度已经基本覆盖到样品中的所有物种。4.总的物种分类统计:24份样本产生了252366条序列,共16220个OTU。251859条序列为细菌序列(99.8%)。在251859条细菌序列里,有176087条序列(69.9%)能被分配到现有的细菌的属水平,包含209个细菌属。注释到各分类等级的OTU比例分别为:门89.8%(14559/16220),纲89.8%(14558/16220),目89.7%(14550/16220),科83.9%(13603/16220),属62.3%(10097/16220)。在门水平,共发现24个细菌门,其中硬壁菌门、变性菌门、放线菌门分别占了43%、37%、10%。在属水平上链球菌属居多,占了25%;其次是罗氏菌属,占了8%;芽胞杆菌属属、不动杆菌属、克雷伯菌属、假单胞菌属分别占了6%、6%、5%、5%。5.各个样本中细菌门、属水平上物种分布情情况:在24份样本中有14份样本都是以变性菌门为主,有7份样本以硬壁菌门为主。所有的样本序列中均出现了变性菌门和硬壁菌门,拟杆菌门出现在21份样本中,放线菌门出现18份样本中。在属水平,有11份样本存在优势菌群,为假单胞菌属、克雷伯菌属、链球菌属、不动杆菌属、嗜血杆菌属、脲原体属、罗氏菌属、芽孢杆菌属。24份样本中不同菌属检出频率出现较高的依次为链球菌属87.5%(21/24),假单胞菌属87.5%(21/24),不动杆菌属83.3%(20/24),甲基杆菌属70.8%(17/24),类芽胞杆菌属70.8%(17/24),葡萄球菌属66.7%(16/24)。6.链球菌属和蜡样芽胞杆菌属的PCR验证:24份样本中有7份样本检测出链球菌属序列比例大于10%。对这7份样本分别进行链球菌属、B组链球菌(GBS)、肺炎链球菌以及轻型链球菌特异性PCR试验。结果显示6份样本的链球菌属和2份样本中的B组链球菌的cfb基因PCR实验出现目标阳性条带。1份样本进行蜡样芽胞杆菌9个基因及其毒力因子p X01-110(pag A)、p X01-122(cya)、p X02-56(cap A)、p BC218-0129基因进行PCR试验,结果显示nhe A、nhe B、nhe C、p BC218-0129基因的PCR扩增目标条带阳性。上述阳性的PCR产物均经测序比对确认为蜡样芽胞杆菌。结论1.新生儿肺炎的细菌种类复杂多样,物种丰富,主要菌属有链球菌属、假单胞菌属、不动杆菌属等。新生儿肺炎除了考虑细菌感染外,也不应该忽视病毒感染,应加强呼吸道病毒的检测,特别是呼吸道合胞病毒。2.泛病原体基因芯片可有效检测出呼吸道病毒,但是对细菌的检测能力有待进一步提高及优化。且芯片的特异性和敏感性尚有待进一步查证。3.与传统细菌培养相比,16S rRNA基因高通量测序方法不仅能发现传统临床实验室检查获得细菌病原学的结果,也能发现传统培养方法不能发现的细菌,为我们揭开一个复杂的细菌群落构成。表明16S rRNA基因测序技术是分析新生儿肺炎有效的方法,可以克服传统方法的局限性。4.当临床上感染的患儿通过常规临床手段检测不出病原体以及临床治疗效果欠佳时,可考虑使用高通量分子生物学的方法来筛查病原体,以便更好地辅助临床治疗。
参考文献：
[1]. NICU常见致病菌寡核苷酸阵列检测方法的研究[D]. 沈德新. 第一军医大学. 2004
[2]. 高通量核酸分析技术在新生儿肺炎病原体检测中的应用[D]. 谢露露. 广州医科大学. 2017
标签：基础医学论文; 致病菌论文; 寡核苷酸论文; 链球菌论文; 病原体论文; 新生儿肺炎论文; 细菌论文; 科普论文; pcr技术论文;