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腺病毒介导人卵泡刺激素基因在山羊乳腺上皮细胞的表达

2020-12-09阅读(510)

腺病毒介导人卵泡刺激素基因在山羊乳腺上皮细胞的表达

论文摘要

卵泡刺激素（FSH）是动物体内最重要的性激素之一,主要作用于生殖细胞,在个体的发育、成熟以及生殖生理方面发挥着关键作用。市场上的FSH主要分为尿源FSH和细胞工程制备的FSH,前者的产量低、来源不均一,后者生产成本高、价格昂贵,不能满足市场需求。目前,动物乳腺制备蛋白药物具有产量高、价格低的特点,但利用大动物乳腺制备FSH的研究还未见报导,主要是因为动物体内的FSH过多会导致动物体的正常生理紊乱,最终导致动物死亡。由于FSH是通过FSHα与FSHβ亚基蛋白非共价键结合形成的异源二聚体糖蛋白,单独的FSHα和FSHβ亚基在动物体内都不具备生物学活性。因此本研究利用腺病毒将人FSHα与FSHβ亚基蛋白分别在山羊乳腺上皮细胞（GMEC）单独表达,然后将单独表达的FSHα和FSHβ亚基蛋白进行体外重组、纯化得到完整的重组人卵泡刺激素（rhFSH）,并利用体外活性试验验证rhFSH具备生物活性。本研究针对山羊乳腺泌乳细胞在体外表达人FSH蛋白进行了探究,为将来利用大动物乳腺制备重组人卵泡刺激素提供技术依据。试验获得如下结果:1.以pIRES-FSH-neo3载体为模板,利用PCR技术,亚克隆得到了FSHα和FSHβ亚基基因。一步克隆法将目的基因分别连接在穿梭载体pAdTrack-CMV上构建了pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ腺病毒穿梭载体。穿梭载体经鉴定后,用PmeI酶切使其线性化,与骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,获得了pAdEasy-FSHα和pAdEasy-FSHβ重组腺病毒载体。2.将鉴定正确的重组腺病毒载体pAdEasy-FSHα和pAdEasy-FSHβ用PacI酶切线性化,用异丙醇沉淀法纯化之后,利用Lipofectamine 2000转染到HEK293A细胞中包装获得第一代重组腺病毒,经扩繁后得到高浓度的重组腺病毒。LaSRT法测得Ad-FSHα和Ad-FSHβ重组腺病毒浓度滴度均为1×109 pfu/mL。3.用重组腺病毒Ad-FSHα和Ad-FSHβ分别感染GMEC细胞,测得重组腺病毒Ad-FSHα的感染复数（MOI）为160,重组腺病毒Ad-FSHβ的MOI值为200。裂解细胞获取蛋白,经Western Blot检测表明,利用重组腺病毒可以在GMEC细胞中有效表达FSHα和FSHβ亚基蛋白。4.将GMEC细胞表达的FSHα与FSHβ亚基蛋白进行体外重组、纯化,利用双抗夹心ELISA法及Western Blot证明FSHα与FSHβ亚基蛋白成功在体外重组成完整的rhFSH。通过观察FSH靶向结合特异性受体（FSHR）及测定HKE-293-FSHR细胞cAMP值,表明体外重组的rhFSH和阳性对照药物Gonal-F同样具备生物活性。综上所述,本研究利用腺病毒介导人卵泡刺激素基因FSHα和FSHβ在山羊乳腺上皮细胞进行表达,产生的FSHα和FSHβ亚基蛋白,经体外重组、纯化得到rhFSH,且验证得出本研究制备的rhFSH具备生物学活性。这就为下一步利用大动物乳腺以及制备转基因动物生产重组人卵泡刺激素奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 卵泡刺激素研究进展
  •     1.1.1 FSH的结构与功能
  •     1.1.2 FSH的应用研究
  •     1.1.3 FSH制剂研究进展
  •     1.1.4 FSH生物活性检测方法
  •   1.2 腺病毒载体研究进展
  •     1.2.1 腺病毒概述
  •     1.2.2 腺病毒载体的分类
  •     1.2.3 重组腺病毒载体系统的分类
  •     1.2.4 腺病毒载体的应用现状
  •   1.3 本研究的目的与意义
  • 第二章 FSHα和 FSHβ基因腺病毒表达载体的构建
  •   2.1 材料与方法
  •     2.1.1 试验材料
  •     2.1.2 试验方法
  •   2.2 结果与分析
  •     2.2.1 FSHα、FSHβ基因亚克隆
  •     2.2.2 穿梭载体的构建及鉴定
  •     2.2.3 重组腺病毒载体的构建及鉴定
  •   2.3 讨论
  •   2.4 小结
  • 第三章 重组腺病毒的包装及扩繁
  •   3.1 材料与方法
  •     3.1.1 试验材料
  •     3.1.2 试验方法
  •   3.2 结果与分析
  •     3.2.1 重组腺病毒的包装
  •     3.2.2 重组腺病毒的扩繁
  •     3.2.3 重组腺病毒的滴度测定
  •   3.3 讨论
  •   3.4 小结
  • 第四章 重组腺病毒在山羊乳腺上皮细胞中的表达
  •   4.1 材料与方法
  •     4.1.1 试验材料
  •     4.1.2 试验方法
  •   4.2 结果与分析
  •     4.2.1 重组腺病毒感染复数MOI值的测定
  •     4.2.2 Western Blot检测FSHα亚基蛋白的表达
  •     4.2.3 Western Blot检测FSHβ亚基蛋白的表达
  •   4.3 讨论
  •   4.4 小结
  • 第五章 体外重组人FSH及其功能鉴定
  •   5.1 材料与方法
  •     5.1.1 试验材料
  •     5.1.2 试验方法
  •   5.2 结果与分析
  •     5.2.1 rhFSH体外重组及鉴定
  •     5.2.2 rhFSH纯化及鉴定
  •     5.2.3 rhFSH生物活性检测
  •   5.3 讨论
  •   5.4 小结
  • 第六章 结论
  • 附录
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 李媛

    导师: 李青旺

    关键词: 腺病毒,山羊乳腺上皮细胞,体外重组,生物活性

    来源: 西北农林科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 西北农林科技大学

    基金: 转基因生物新品种培育重大专项(编号:2018ZX0801013B)

    分类号: Q78

    总页数: 65

    文件大小: 4881K

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