王南[1]2003年在《槲皮素对小鼠T细胞行为的药理学作用》文中研究指明目的： 以体外T细胞的活化、增殖和凋亡为模型，研究天然黄酮类药物槲皮素对T细胞行为的药理学作用及其分子机理，为基于天然化合物的新型免疫抑制剂的开发提供免疫学依据。 方法： 利用荧光抗体标记、二乙酰羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯(carboxyfiuorescein diacetate，succinimidyl ester or CFDA-SE，CFSE)染色及膜联蛋白V-藻红蛋白(Annexin V-PE)、7-氨基-放线菌素(7-amino-actinomycin，7-AAD)染色，结合流式细胞术检测，分析经刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)刺激或2-丁酸佛波醇酯(phorbol 12，13-dibutyrate，PDB)与离子霉素(ionomycin，Ion)共同刺激后，小鼠T细胞在不同时点CD69及CD25表达水平、CFSE荧光强度及Annexin V+ 7-AAD~-细胞比例，以及不同浓度槲皮素对这些参数的影响，了解药物对T细胞的活化、增殖与凋亡等细胞行为的效应。 2003届硕士学位论文 懈皮素对小鼠T细胞行为的药理学作用结果： （1）在COnd或PDB刺激下，不同浓度懈皮素处理组门pM 10 p M，pp 以M）较对照组＊＊3”细胞＊＊69表达率在Zb、6h、24b均明显下降（P＜0刀1）， 且存在剂量依赖关系。ConA或（PDB＋Ion）刺激48h后，懈皮素组较对 照组CD3＋细胞CD25表达率均明显下降，且存在剂量依赖关系。 ＊）在（PDBHon师激下，不同浓度懈皮素处理组在48h刀2h均较对照组CFSE 衰减程度明显下降（P＜0刀1），且存在剂量依赖关系，与檄皮素结构类似 的杨梅黄酮无此抑制作用，而环抱素A可增强棚皮素的效应。 （3）在 ConA及（PDB＋Ion）刺激下各不同浓度棚皮素处理组 Annexin V”7－AAD－ （即凋亡细胞）占总T细胞百分率在各时间点均较对照组明显上升 （P＜0刀1），且存在剂量依赖关系。结论： 懈皮素对ConA或（PDB刊on）刺激后T细胞的活化与增殖均有明显抑制作用，推测通过竞争PKC 0上PDB的正位结合位点或结合PKC日上PDB的异位结合位点，抑制PKC 9的激活，进一步抑制AP－l、NFA及NF－K B等转录因于的活化，使IL－二等细胞因子的生成减少，最终改变了T细胞微环境而抑制T细胞的活化与增殖。硼皮素对T细胞增殖的抑制作用具有结构特异性，并可与环抱素A的作用协同。同时橱皮素也可显着促进ConA及（PDB＋Ion）刺激活化后诱导的T细胞凋亡，推测其可能通过抑制蛋白激酶或作用于FasNasL及其下游凋亡通路中的某个环节而促其凋亡。综上所述，棚皮素可显着抑制T细胞的活化和增殖，同时促进活化诱导的T细胞凋亡，是潜在的兔疫抑制剂。棚皮素为天然植物提取物，副作用小。且棚皮素与经典兔疫抑制剂协同作用，为二者联合用药，减轻后者副作用提供可能。
舒孝顺[2]2005年在《菝葜提取工艺的改进及药理学研究》文中认为菝葜(Smilax china L)又名金刚藤,是百合科菝葜属的一种多年生落叶攀援灌木,药用其根茎。目前临床上主要用于妇科盆腔炎等疾病的治疗,有较好疗效。目前的菝葜制剂主要为40%乙醇提取物制成的糖浆、胶囊剂等,采用的仍是水煮醇沉工艺,活性成分难以得到保证,有效成分较低、服用量大,同时对有效作用部位及治疗盆腔炎等疾病的相关药理学没有进行过较系统全面的研究,影响了其在临床上的进一步推广应用。本文通过膜分离技术对菝葜原有提取工艺进行改进,以两种黄酮和薯蓣皂苷为质量控制指标,建立了HPLC 含量测定方法,同时结合其主治病症盆腔炎、慢性盆腔炎等疾病相关药理学模型,如抗炎、镇痛、免疫抑制、抗菌等,对其治疗及机理进行了探讨,研究结果给菝葜的临床用药及进一步开发利用提供了理论及实验依据。本文完成的主要工作如下:1. 改进了菝葜提取物制备工艺并对其中的薯蓣皂甙元、山柰酚和槲皮素进行了HPLC定量分析通过膜分离技术对菝葜原有生产工艺进行了改进,并对其有效成分进行了测定。用纯甲醇为流动相在室温(25℃)和流速为1ml·min-1 时测得薯蓣皂甙元的保留时间为12.35min 左右; 用水?乙腈?磷酸?叁乙胺(65:35:0.27:0.45)作为流动相,流速0.7ml·min-1和在室温(25℃)时测得山柰酚和槲皮素的保留时间分别为24.32min 和13.94min 左右; 且薯蓣皂甙元和山柰酚主峰与相邻杂峰分离度均大于2,达到了色谱分离的要求,槲皮素主峰也与相邻杂峰获得了较好的分离效果。HPLC 分析表明水提醇沉提取物、膜分离物和乙酸乙酯提取物中薯蓣皂苷元、槲皮素和山柰酚含量依次为0.0183%,0.0299%和0.1446%; 0.0102%,0.0164%和0.1836%; 0.0076%,0.0093%和0.1232%。该方法精密度和重现性均较好。同时表明了膜分离工艺代替传统工艺提纯金刚藤有效成分、去除杂质是可行的。2. 菝葜不同提取物的抗炎作用研究采用蛋清致足肿胀、甲醛致足肿胀、二甲苯致耳肿胀和醋酸致腹膜炎模型对菝葜不同提取物对急性、早期炎症的抗炎作用进行了研究,结果表明:在100g·生药/kg 剂量下,各提取物能显着降低蛋清诱导的大鼠足跖肿胀程度,活性大小依次为乙酸乙酯提取物>膜分离物>水提物; 此外,还能明显抑制甲醛诱导的小鼠足肿胀程度、小鼠腹腔毛细血管通透性增高和二甲苯诱导的耳廓肿胀,活性依次为水提物>乙酸乙酯提取物
肖显华, 王肖萱, 刘力生, 张龙弟, 郑荣梁[3]1987年在《槲皮素对小鼠L7712白血病细胞DNA合成及对人淋巴细胞姊妹染色单体交换的影响》文中研究表明已有报道槲皮素能显着抑制促癌剂的作用、抑制离体恶性细胞的生长、抑制艾氏腹水癌细胞DNA、RNA和蛋白质的合成、诱发艾氏腹水癌细胞cAMP的增多。 本文用[~3H]胸苷参入小白鼠白血病L7712细胞DNA作为指标,测出槲皮素对DNA合成的半抑制浓度为33.4μg/ml。用Painter方测槲皮素对DNA合成速率的后作用表明即使把槲皮素从细胞培养液中清除后1—3 h,
杜西翠[4]2014年在《槲皮素对LPS致小鼠胚胎着床障碍及子宫损伤的保护作用》文中进行了进一步梳理LPS是革兰氏染色阴性杆菌细胞壁的主要组分之一。在妊娠早期，动物接触LPS可以引发多种不良结局，如胚胎吸收或死胎以及自发性流产等等。研究证实，槲皮素(Quercetin)具有多种药理作用，比如抗炎作用、抗氧化及清除氧自由基的作用，此外还有免疫调节的功效。因此，槲皮素可以有效地对抗LPS对子宫造成的损害。本试验首先筛选出LPS致小鼠胚胎着床障碍的最佳剂量，然后通过LPS构建小鼠胚胎着床障碍的模型，ELISA和RT-PCR法分别检测小鼠血清及子宫组织中IL-10和TNF-α的含量及其mRNA的表达，运用Western blotting和RT-PCR方法分别检测小鼠子宫组织中TLR4/NF-κB蛋白及其mRNA的表达，研究槲皮素对细菌脂多糖（LPS）诱导的小鼠子宫组织中TLR4/NF-κB信号通路的影响，并探讨其分子机制。选取未经产的雌性昆明小鼠60只，经正常饲养7d后与雄性小鼠交换垫料，用无菌棉签蘸取小鼠阴道黏液做成涂片在显微镜下观察，进行发情鉴定。确定发情的母鼠与公鼠1:1合笼过夜，第二天清晨进行检查，发现阴栓的小鼠则定为怀孕0d。将怀孕母鼠随机分为6组（10只/组），分别为对照组和5个不同剂量的LPS组。于孕4d、5d对照组小鼠尾静脉注射PBS，其余各组分别尾静脉注射0.2μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml和5.0μg/ml的LPS。孕6d剖检，观察子宫生长情况，从着床胚胎数和子宫重量两个方面分析确定胚胎着床障碍模型的最佳剂量。结果显示，不同浓度的LPS可以不同程度地阻碍小鼠胚胎着床，使胚胎着床数减少。随着LPS浓度的增加，各组小鼠子宫明显变小，床数胚胎数、子宫重量均有所降低，其中LPS浓度为0.2μg/ml和0.5μg/ml组的着床胚胎数、子宫重量与对照组相比无统计学意义，2.0μg/ml和5.0μg/ml LPS组小鼠胚胎着床数太低，不适合用于以后的试验，而1.0μg/ml LPS组平均胚胎着床数、子宫重量明显低于对照组（P<0.05），又不至于太低，因此，1.0μg/ml的LPS浓度可以作为小鼠胚胎着床障碍模型的最佳剂量。将50只怀孕母鼠随机分为5组（10只/组），分别为对照组、模型组和3个不同剂量的槲皮素组。在小鼠怀孕1-3d时，对照组和模型组灌服生理盐水，槲皮素组分别灌服0.25、1.25、2.5mg/ml的槲皮素，在小鼠怀孕4d、5d时，模型组和各槲皮素组分别尾静脉注射LPS，对照组尾静脉注射PBS。HE染色观察子宫病理学变化，ELISA和RT-PCR方法检测IL-10和TNF-α含量及其mRNA的表达，Westernblotting和RT-PCR方法检测NF-κB和TLR4蛋白的表达量及其mRNA的表达。子宫组织病理结果显示，槲皮素对LPS诱导的小鼠子宫组织结构损伤有明显的改善作用，2.5mg/ml的槲皮素组与模型组比较有显着改善；ELISA的试验结果表明：LPS使小鼠血清中IL-10的含量下降，TNF-α的含量上升，诱导炎症反应的发生，使免疫调节向着有害于妊娠的Th1方向进行，但是造模前事先灌服了槲皮素后，小鼠血清中IL-10的含量明显升高，TNF-α的含量也降了下来，有效地控制了炎症反应，并且与RT-PCR的结果保持一致；Western blotting结果表明，LPS能有效增加小鼠子宫内胞浆TLR4蛋白和胞核NF-κB蛋白的表达量；0.25mg/ml的槲皮素作用后，小鼠子宫内胞浆TLR4蛋白和胞核NF-κB蛋白的表达与模型组没有显着差别；1.25mg/ml的槲皮素作用后，小鼠子宫内胞浆TLR4蛋白和胞核NF-κB蛋白的表达低于模型组；2.5mg/ml槲皮素作用后，小鼠子宫内胞浆TLR4蛋白和胞核NF-κB蛋白的表达显着地低于模型组，随着槲皮素剂量的增加，胞浆TLR4蛋白和胞核NF-κB蛋白的表达呈剂量依赖性降低；RT-PCR结果显示，LPS作用后小鼠子宫中TLR4mRNA和NF-κB mRNA的表达丰度与对照组相比显着升高（P<0.05）；与模型组相比槲皮素各处理组TLR4mRNA和NF-κB mRNA的表达水平明显下降（P<0.05），且随着槲皮素浓度的升高其相对表达呈剂量依赖性。氧化指标测定的结果显示，模型组小鼠血清中SOD和GSH-PX的活性分别降低了30.10%和38.94%，MDA和NO的水平升高了29.96%及42.44%，而槲皮素处理组的水平都逐渐恢复至正常水平，说明槲皮素可抑制脂多糖所导致的氧化应激，具有抗氧化作用。结论：LPS可以阻碍小鼠胚胎着床并引起子宫组织受损，使Th1/Th2免疫平衡向不利妊娠的Th1方向进行；使TLR4/NF-κB信号通路被激活，导致各种炎症反应的产生。槲皮素可以修复LPS对小鼠子宫组织造成的损伤；缓解LPS诱导的胚胎着床障碍，使免疫平衡向着有利于妊娠的Th2方向偏移，起到保胎作用；可以有效地阻断LPS介导的TLR4/NF-κB信号转导通路的进行。
程嘉艺[5]2008年在《沙棘总黄酮抗栓作用机制及有效成分初探》文中认为目的:观察沙棘总黄酮口服给药对光化学反应血栓模型的影响;在在体及细胞水平探讨沙棘总黄酮抗栓作用机制;对沙棘总黄酮抗栓活性成分进行初步分析。方法:采用光化学血栓模型观察沙棘总黄酮口服给药对血栓形成的影响,观察指标为目标血管血流完全停止时间和490nm波长绿色光照射后不同时间血流速度;采用全血血细胞计数法测定小鼠血小板聚集性、采用ELISA法小鼠血浆von Willebrand因子含量;采用人脐静脉内皮细胞系ECV304,以H2O2制备血管内皮细胞损伤模型;采用MTT法测定内皮细胞相对活力;采用流式细胞仪测定内皮细胞坏死率和平均荧光强度的的变化;采用ELISA法检测细胞培养液中t-PA、PAI-1、vWF、TM蛋白的含量;采用荧光分光光度法测定内皮细胞培养液中LDH的含量;采用共聚焦激光扫描显微镜测定细胞内游离钙离子浓度;采用RT-PCR技术测定PAI-1 mRNA的相对表达;采用Western Blot法测定内皮细胞caspase-3活性。结果:1.0、3.0、10.0g/kg剂量的沙棘总黄酮剂量依存性地将血流完全停止时间分别提高至41.0±2.1、50.5±1.6、56.0±2.1min,ρ<0.01;沙棘总黄酮明显提高模型小鼠血流速度,作用时间随剂量增加而延长。各剂量沙棘总黄酮明显增加模型小鼠全血血小板数,中、高剂量明显降低小鼠血浆vWF浓度(ρ<0.05或ρ<0.01),低剂量对小鼠血浆vWF浓度无明显影响。H2O2浓度依赖性抑制ECV304细胞的活性,200μM的H2O2可使内皮细胞活性被抑制66%。400.0、200.0μg/ml的沙棘总黄酮提高H2O2损伤ECV304细胞的活力,ρ值分别小于0.01、0.05; 11.4μg/ml、5.7μg/ml的异鼠李素可提高H2O2损伤后内皮细胞相对活力,但22.8μg/ml异鼠李素则无此作用;400.0μg/ml的沙棘总黄酮组内皮细胞活性被抑制程度明显低于相对应的异鼠李素组。不同浓度的沙棘总黄酮、异鼠李素、槲皮素均显着降低H2O2损伤后内皮细胞死亡率(P<0.05),其中中、低浓度异鼠李素的作用显着强于高浓度组,ρ<0.05或ρ<0.01;高浓度槲皮素降低细胞死亡率的作用明显强于相应浓度的沙棘总黄酮,而高浓度的异鼠李素则明显弱于相应浓度的沙棘总黄酮。沙棘总黄酮和异鼠李素均可剂量依赖性抑制ECV-304细胞PAI-1的分泌,与空白对照组相比,两者高、中剂量组均有显着性差异(ρ<0.01),低剂量组无显着性差异,PAI-1的mRNA表达结果与此相同;沙棘总黄酮和异鼠李素对ECV-304细胞分泌t-PA和vWF均无明显影响。除22.8μg/ml异鼠李素外,各浓度的沙棘总黄酮、槲皮素、异鼠李素均明显抑制H2O2所致内皮细胞培养液中TM蛋白含量增加;沙棘总黄酮与相应浓度的异鼠李素和槲皮素的作用没有差异。沙棘总黄酮、异鼠李素、槲皮素均明显抑制H2O2所致内皮细胞LDH泄露(ρ<0.01),其中槲皮素的作用随浓度增加而有增强的趋势,而高浓度异鼠李素的作用则明显弱于中的浓度组,ρ<0.05。沙棘总黄酮和槲皮素均可对抗H2O2所致ECV304细胞胞浆内钙离子浓度升高,但异鼠李素没有该作用,特别是高浓度的异鼠李素有加重钙超载的作用。沙棘总黄酮、异鼠李素、槲皮素均明显抑制H2O2损伤内皮细胞caspase-3活性(ρ<0.01);高浓度异鼠李素的作用明显弱于相应浓度的沙棘总黄酮(ρ<0.01),高浓度槲皮素的作用则明显强于相应浓度的沙棘总黄酮(ρ<0.05)。结论:(1)沙棘总黄酮口服给药有抗血栓作用。(2)沙棘总黄酮抑制血小板活性,是其抗栓作用的机制之一。(3)沙棘总黄酮对过氧化损伤内皮细胞的保护作用,是其抗栓作用的机制之一。(4)沙棘总黄酮抑制钙超载、降低Caspase-3表达,是其内皮细胞保护作用机制之一。(5)异鼠李素、槲皮素是沙棘总黄酮抗栓作用活性成分。(6)高浓度的异鼠李素可能损伤内皮细胞。(7)沙棘总黄酮抗栓作用是多靶点的。
黄暨生[6]2016年在《木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究》文中研究说明恶性肿瘤是21世纪以来严重危害人类健康的主要疾病之一,是目前导致人类死亡的主要原因之一。随着细胞生物学和分子生物学日新月异的发展,基因治疗对恶性肿瘤的治疗有着重要作用,特别是自杀基因治疗,已经成为继传统治疗手段(如手术治疗、放疗、化疗等)后一种治疗肿瘤最具希望和挑战的措施。本研究通过构建重组慢病毒介导的绿色荧光示踪蛋白单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统基因载体,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,在确定黄酮类中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素对细胞缝隙连接功能(GJIC)的促进作用,进一步将中药活性成分与自杀基因治疗系统组成联合治疗方案,研究中药活性成分联合自杀基因治疗系统的增效作用,通过本研究探讨将自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案的可行性。一、方法(一)人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建设计引物,提取HEK293细胞总RNA, PCR反应扩增tk基因后,产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收。对tk基因PCR扩增产物及CD511B质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5a,提取质粒。重组质粒使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定；将构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒质粒命名为pLV-tk/GFP。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建用该重组质粒pLV-tk/GFP与包装质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,用嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞株；使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,GCV杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。将筛选获得稳定表达细胞命名为A375-tk/GFP.(二)木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1 MTT法检测人黑色素瘤细胞A375生长曲线。2 MTT法检测0～100μmol/L木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长的影响,以确定用于研究的药物浓度。3荧光显微镜观察及流式细胞仪荧光示踪法分析缝隙连接通讯(GJIC)功能变化。用预标记双染料传输流式细胞术检测0～20μmol/L木犀草素、0-10μmol/L芹菜素及0～20μmol/L槲皮素对A375细胞GJIC功能的影响,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。检测并计算单绿色荧光细胞数量与荧光双阴性细胞数量的比值,作为评价GJIC功能的指标；比值越大表示细胞间形成GJIC功能越强。4 Western Blot检测0～20μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞缝隙连接蛋白Cx43、Cx26表达的影响,对图像进行扫描分析。(叁)木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测0、2、5μmol/L GCV对0、20%、40%、60%、80%、100% A375-tk/GFP(tk+)细胞混合A375(tk-)细胞作用72h生长的影响,以确定联合作用GCV浓度和tk+细胞的混合比例。2 MTT法检测杀伤效应。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到96孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以MTT检测各组杀伤效应。3荧光显微镜观察及流式细胞仪PI单染分析细胞凋亡。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到12孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以PI单染,流式细胞仪检测各组细胞凋亡的情况,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。二、结果(一)人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建重组慢病毒质粒pLV-tk/GFP分子量约为10.0kb,经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,证明目的基因tk已经成功连接到载体正确位置,测序结果与原始载体序列比对,相应序列100%完全一致,证明携带目的基因HSV1-tk的质粒pLV-tk/GFP构建成功。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建pLV-tk/GFP感染A375细胞用0 .5μg/mL嘌呤霉素维持筛选浓度2周,荧光显微镜观察GFP的表达随着时间的延长而逐渐增多、荧光增强,最终获得重组基因整合到染色体上的稳定表达细胞株,命名为A375-tk/GFP。采用MTT法检测GCV对A375细胞、A375-tk/GFP细胞进行杀伤试验,GCV作用72h的细胞存活率结果显示,GCV对A375-tk/GFP细胞有明显的杀伤作用,而对未感染重组慢病毒的对照组A375细胞无明显细胞毒作用。结果表明重组质粒经包装后产生上清液含具有感染性的病毒颗粒,感染细胞后筛选的阳性抗性克隆细胞A375-tk/GFP能正常表达tk/GFP基因,表达产物具有生物活性。(二)木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长有较为明显的抑制效应,6.25～100μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞杀伤作用呈时间和剂量依赖关系；本研究主要探讨木犀草素、芹菜素及槲皮素通过GJIC或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用2.5～20μmol/L木犀草素、芹菜素及5～40μmol/L槲皮素进行后续试验。2流式细胞术及Western Blot检测细胞缝隙连接功能和缝隙连接蛋白的表达,结果发现木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高肿瘤细胞缝隙连接蛋白的Cx43和Cx26表达水平,促进缝隙连接通讯的功能从而起到与自杀基因治疗系统的协同增效作用,旁观者效应也可能是通过GJIC机制发生的。(叁)木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测2、5μmol/LGCV对20%～100% A375-tk/GFP细胞混合比例作用72h后,对显着的杀伤作用,为了观察木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV治疗系统,通过缝隙连接机制或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用5μmol/L GCV和20% A375-tk/GFP细胞混合比例进行后续实验验。2木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV组对肿瘤细胞的抑制率明显比相应浓度单药组和单纯tk/GCV组高(P<0.05),说明木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV系统能显着提高tk+和tk-混合细胞对GCV的敏感性。5、10μmol/L木犀草素联合tk/GCV组,5、10、20μmol/L芹菜素联合tk/GCV组,10、20μmol/L槲皮素联合tk/GCV组,Q值均≥1.15,说明5、10μmol/L木犀草素、5、10、20μmol/L芹菜素及10、20μmol/L槲皮素具有协同性增强tk/GCV系统杀伤效应的作用。3 PI单染检测细胞凋亡结果显示,各中药活性成分联合tk/GCV组的细胞凋亡率均高于单纯中药活性成分组,PI单染法检测结果各组细胞凋亡率的趋势与MTT结果一致,实验证明,木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375-tk/GFP自杀基因治疗系统具有增效作用。叁、结论及展望上述实验结果表明：①我们已成功构建了绿色荧光示踪蛋白慢病毒介导的HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统；②中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高缝隙连接蛋白的表达水平促进细胞间缝隙连接功能；③将中药活性成分和自杀基因疗法组成联合治疗方案,对人黑色素瘤自杀基因治疗系统具有协同增效作用。通过对人恶性黑色素瘤治疗的实验研究,表明自杀基因疗法联合中药方药活性成分,能够通过促进缝隙连接机制发挥协同抗肿瘤作用,中药方药活性成分能够提高肿瘤自杀基因治疗的效果。初步证明了建立自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案具有可行性。将中药方药活性成分与肿瘤自杀基因治疗联合,体外实验对自杀基因治疗系统旁杀伤效应的研究结果显示,中药方药活性成分能协同增强肿瘤自杀基因旁杀伤效应的效果,其可能机制与中药方药活性成分通过促进细胞间缝隙连接通讯功能(即缝隙连接机制)发挥作用。进一步可以将其他的中药方药活性成分或旁杀伤效应的其他增效机制,以及体内实验研究做为我们今后研究工作方向的重点。目前肿瘤自杀基因治疗尚未成熟,但通过将祖国传统医学与现代医学结合,联合自杀基因治疗的增效作用的研究、建立及优化工作将大有可为。
袁杰[7]2014年在《菝葜抑制α-葡萄糖苷酶活性成分的研究》文中研究说明菝葜为百合科植物菝葜(Similax China L.)的干燥根茎,又名“金刚藤”。菝葜植物资源丰富,具有祛风利湿、解毒消痈之功效。现代药理试验研究表明,菝葜具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、降血糖等药理作用。目前菝葜的研究主要集中在抗炎、抗肿瘤方面。本论文对菝葜降血糖的物质基础进行了研究,以期为该药用植物的综合开发利用提供科学依据。在a-葡萄糖苷酶抑制活性示踪下,菝葜药材采用70%乙醇回流提取,提取液回收乙醇,通过D101大孔吸附树脂柱,依次用水、60%乙醇洗脱。确定了乙醇提取物为有效部位；采用ODS层析柱法,将乙醇提取物分离为8个流分段,进一步明确了菝葜药效物质部位；采用硅胶柱法分离得11个化合物,从而为分离鉴定该药用植物降血糖活性成分奠定了基础。采用综合色谱分离方法,从菝葜有效部位中到11个单体成分,分别为：槲皮素(Ⅰ)、3-脱氢水飞蓟宾(Ⅱ)、槲皮素-3-α-L-鼠李糖苷(Ⅲ)、3,4-二甲氧基肉桂酸(Ⅳ)、氧化白藜芦醇(Ⅴ)、山柰酚(Ⅵ). Aiphanol (Ⅶ)、水飞蓟宾(Ⅷ)、南方贝壳杉双黄酮(Ⅸ)、南方贝壳杉双黄酮-4'-甲基醚(Ⅹ)、白藜芦醇(Ⅺ)。采用α-葡萄糖苷酶抑制活性测定方法对菝葜降血糖有效部位中分离鉴定的11种化合物进行了筛选研究。结果表明,从该药材中分离得到的多种化合物对α-葡萄糖苷酶有明显的抑制活性,提示菝葜的降血糖活性可能来自这些化合物的作用。其中槲皮素-α-鼠李糖苷对α-葡萄糖苷酶抑制活性强于槲皮素,但进一步的分析结果表明,反应中槲皮素-α-鼠李糖苷并没有被酶解。也许是因为这种化合物的α-鼠李糖苷与底物的α-葡萄糖苷具有相似的糖基链,该化合物更容易与α-葡萄糖苷酶结合,从而产生抑制酶的活性。或许,由于结构中的α-鼠李糖苷与α-葡萄糖苷不尽相同,前者只是绑定在酶上,但不能被其水解。这一结果提示,化合物中添加鼠李糖苷以合成更强有力的α-葡萄糖苷酶抑制剂,也许是一个可行的策略。从而为诠释菝葜降血糖的物质基础提供了依据。
辛欣[8]2013年在《五甲基槲皮素抗糖尿病大鼠肾脏纤维化的作用及机制研究》文中研究表明五甲基槲皮素是多甲氧基黄酮类化合物中的一员,主要存在于沙棘果实及山奈属植物的根茎中。本实验室以槲皮素为原料,采取全甲基化的方法,成功合成了五甲基槲皮素,解决了其天然来源较为困难的问题,为研究其药理学作用提供了保障。我们的前期实验已证明,五甲基槲皮素的药效学作用有：改善乳鼠腹腔注射链脲佐菌素诱导的糖尿病模型的高血糖症状,上调3T3-L1前脂肪细胞脂联素水平,阻止心肌肥大以及改善代谢综合征等。同时,我们发现,五甲基槲皮素不仅可以改善糖尿病大鼠的高血糖症状,还能够有效地减少尿量。由此,我们试图探究其对糖尿病条件下肾脏的作用,尤其关注糖尿病肾病中最为典型的肾脏纤维化的病理变化。因此,本课题根据文献报道,选择了症状与糖尿病人相似的,自发型II型糖尿病GK大鼠为动物模型,探讨五甲基槲皮素对该模型肾脏纤维化的作用。同时,采用高糖诱导肾小球系膜细胞,模拟糖尿病时的体内环境,在细胞水平进一步研究五甲基槲皮素抗肾脏纤维化的作用及可能的机制。目的：研究PMQ对自发型II型糖尿病GK大鼠肾脏纤维化及高糖培养的系膜细胞纤维化指标的作用,并探讨其可能的作用机制。方法：(1)在整体动物中,12周龄的雄性GK大鼠随机分为5组：GK大鼠模型组,PMQ5、10、20mg/kg组,阳性药二甲双胍300mg/kg组,同龄的雄性Wistar大鼠作为对照组,每组7-9只。每周对各组大鼠体重、饮水及进食情况进行监测。给药后15周检测各组大鼠空腹及餐后血糖、胰岛素水平,以及空腹甘油叁酯和总胆固醇水平。给药16周后,进行口服糖耐量实验。实验结束前,监测各组大鼠24h尿量、尿糖、尿白蛋白、肌酐及尿素氮水平,并计算尿白蛋白排泄率。实验结束时,摘取两侧肾脏称重,并结合体重计算肾脏指数；通过对肾脏的PAS及Masson染色进行病理学检测。同时,在mRNA及蛋白水平上,检测纤维化相关因子纤粘蛋白及Ⅳ型胶原的表达情况。(2)在细胞水平上,采用高糖培养系膜细胞,并加入PMQ1、3或10μM或卡托普利100μM干预48h后,进行后续实验。分别采用CM-DiI染色检测细胞大小,MTT法检测细胞增殖及天狼星红染色法检测胶原总量；同时,在mRNA及蛋白水平上,检测纤维化相关因子纤粘蛋白及Ⅳ型胶原的表达情况。(3)检测在各组大鼠肾脏组织及高糖诱导各组的系膜细胞中TGF-β1、Smad7、Smad2/3及p-Smad2/3mRNA与蛋白水平表达情况。结果：(1)在整体动物上,与GK大鼠相比,PMQ给药组在以下几方面具有改善作用：a.改善糖脂代谢,胰岛素抵抗及糖耐量受损情况。b.改善多尿症状,降低尿糖水平及肾脏指数。c.减轻肾小球肥大及糖原沉积。d.在mRNA及蛋白水平,降低纤粘蛋白及Ⅳ型胶原的表达。(2)在细胞水平上,与高糖组相比,PMQ给药组可抑制高糖导致的系膜细胞过度增殖,细胞肥大以及总胶原的积累,在mRNA及蛋白水平,降低纤粘蛋白及Ⅳ型胶原的表达。(3)在大鼠肾脏组织及系膜细胞中,与模型组相比,在mRNA及蛋白水平上,给予PMQ后,可降低其TGF-β1及Smad2/3磷酸化的水平,升高Smad7的表达。结论：(1)GK大鼠除了具有典型的II型糖尿病症状外,还表现出肾脏纤维化的病理改变。(2)PMQ除了可改善GK大鼠糖尿病相关症状外,还可显着预防GK大鼠肾功能受损及肾脏纤维化。(3)PMQ可显着抑制高糖导致的系膜细胞过度增殖,细胞肥大及总胶原的积累。(4)PMQ改善糖尿病环境下肾脏纤维化的作用可能与抑制TGF-β/Smads信号通路有关。
胡婧[9]2012年在《珠芽景天的鉴定、黄酮类成分含量测定及抗肿瘤活性研究》文中研究说明珠芽景天系景天科景天属植物珠芽景天（别名马尿花）Sedum bulbiferumMakino的新鲜或干燥全草，是我国的一种民族民间药。春末初夏时采收，鲜用或晒干备用。文献记载，该品用于食积腹痛、风湿瘫痪、疟疾等病症，尚有止血作用，在湘西土家族还用于治疗痈肿疔疖、跌打损伤、烫伤、蛇伤等。珠芽景天广泛分布于我国多个省区，野生资源丰富，有一定的开发利用价值。关于珠芽景天的生药学及活性研究报道很少，尚缺乏系统的品质鉴定分析方法。因此，笔者对该植物药进行了药材性状、显微特征、薄层色谱、黄酮类成分含量测定、总黄酮的提取与纯化、各提取部位的体外抗肿瘤活性等方面的研究，建立了初步的质量分析方法；并与同属近缘植物药（药用植物）垂盆草、佛甲草、凹叶景天进行了薄层色谱的比较研究，同时结合4者茎的显微构造的相似性，初步探讨了相互之间的亲缘关系。性状、显微及薄层色谱鉴定研究表明，珠芽景天鉴别特征明显，如茎横切面的皮层外侧及中柱薄壁组织散布有紫红色细胞，髓部细胞较小，壁不增厚（同属部分植物茎髓部细胞壁增厚）；叶下表皮气孔密布，常可见2个（有时3个）相距较近；全草薄层色谱中具多个特征性荧光斑点，并与对照品槲皮素色谱相应位置上有相同颜色的斑点。相对于垂盆草、佛甲草、凹叶景天的显微特征，珠芽景天茎横切面内、外侧皮层细胞壁不增厚，髓部略呈类圆形，细胞壁不增厚，以及叶上、下表皮细胞表面观呈不规则形，壁呈显着的波状弯曲等特征，而易于将本品与上述叁个不同来源的同属植物药相区别。薄层色谱中，珠芽景天、凹叶景天与垂盆草、佛甲草相比，相似程度相对较小，推测与它们的亲缘程度略远；而垂盆草、佛甲草绝大部分色谱斑点（共有9个共性色谱斑点）一一对应，加之二者茎的显微构造十分相近，推测二者亲缘关系较为密切。通过HPLC法对样品进行分析，发现珠芽景天的水解产物含有槲皮素、山柰素等黄酮类成分。故以不同采收时间的珠芽景天样品为材料，建立了其槲皮素、山柰素成分的HPLC测定法。该法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（YMC-Pack ODS-A柱，250mm×4.6mm，5μm），甲醇-0.4%磷酸溶液（50:50）为流动相，检测波长为360nm，柱温30℃，流速为1.0mL·min~(-1)，进样量10μL，并进行相应的方法学考察。结果槲皮素、山柰素进样量分别在0.03～0.36μg、0.08～0.96μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（相关系数r=0.9999），平均加样回收率分别为98.90%、98.27%，相对标准差RSD均小于1.70%（n=6）。建立的HPLC法准确可靠、重现性好，可用作珠芽景天有关活性物质含量控制的参考依据。同时对珠芽景天总黄酮的含量进行了测定，测定结果表明，4月下旬的样品中槲皮素、山柰素的含量均明显高于5月与6月样品，4月下旬与5月中旬样品的总黄酮含量高于6月样品，故初步认为该药材以4月下旬至5月中旬采收为宜。珠芽景天总黄酮提取纯化的研究表明，大孔树脂所得的富集物黄酮含量偏低；将过大孔树脂柱后的富集物再过聚酰胺柱，即采用大孔树脂-聚酰胺联用技术具有较好的富集效果，所得黄酮富集物的总黄酮含量达到了52.1%，为进一步研究珠芽景天总黄酮的药理活性奠定了基础。利用四氮唑盐还原法（MTT法），以人的肿瘤细胞（人肝癌细胞株HepG2、人食管癌细胞株EC109、人结肠癌细胞株SW480）为筛选模型，进行了珠芽景天的乙酸乙酯、正丁醇提取部位及总黄酮提取物的体外抗肿瘤活性研究，结果其总黄酮提取物及乙酸乙酯提取部位对3种癌细胞株都有较好的抑制作用，其作用都随着浓度的增加而增强，在测定浓度范围内呈良好的剂量依赖性抑制作用。鉴于已知总黄酮的抗肿瘤活性强，以及黄酮类成分在乙酸乙酯中的含量较高，由此初步判断黄酮类是珠芽景天药材的主要抗肿瘤有效成分。综上所述，笔者对珠芽景天药材进行了较为系统的生药学研究，为该植物药材的鉴定、品质分析、质量标准的建立及资源的开发应用奠定了基础，同时也为景天属其它植物药用的品质鉴定及研究应用提供了一定的参考。
肖义军[10]2007年在《寄主为夹竹桃的红花桑寄生提取物（Nispex）的抗肿瘤作用及其成分研究》文中研究表明恶性肿瘤严重困扰人类健康。由于目前临床常用抗肿瘤药物大多存在严重的毒副作用以及肿瘤细胞耐药性的问题,不断寻找新的高效低毒的抗肿瘤药物一直是抗肿瘤研究的重要课题。从植物中寻找天然抗肿瘤活性成分是研究抗肿瘤药物的一条重要途径,目前临床上常用的抗肿瘤药物如紫杉醇、长春新碱、喜树碱、足叶乙苷、叁尖杉酯碱均来源于植物。除了从植物中分离单一结构的药物成分外,传统的植物药物近几年来在德国、法国、意大利和瑞士等欧洲国家也得到了科学界的承认和应用。由于肿瘤发生发展的多因性,针对肿瘤发生发展过程中的多种分子靶标、多种信号途径进行肿瘤的联合治疗可能会比单一药物成分的治疗有更好的治疗效果。而植物药的特点正是药效物质多成分、多途径、多靶点的整体作用。将抗肿瘤植物药作为传统化疗药物的增效减毒剂应用于恶性肿瘤的治疗是今后抗肿瘤研究的重要方向之一。Nispex是我们首次从寄主为夹竹桃的红花桑寄生叶中提取分离的主要含多酚类成分一种抗肿瘤植物提取物。文章分四个部分对其制备方法、成分、体内外抗白血病细胞株HL-60的效果、抑瘤机制、抑瘤作用的广谱性等进行了研究,还研究对比了不同寄主来源红花桑寄生提取物的体外抑瘤效果。第一部分为Nispex的制备方法和成分分析。Nispex系寄主为夹竹桃的红花桑寄生叶80%乙醇提取物经聚酰胺柱层析纯化所得,按药材重量计得率约为3%。采用颜色鉴定反应、高效液相-质谱联用分析和资料对比分析,Nispex中主要含槲皮素、槲皮苷、广寄生苷等黄酮类成分和与夹竹桃成分类似的强心苷类成分以及生物碱类成分。以芦丁为对照品测得的黄酮含量为72.37%。第二部分为本文的重点研究部分。测定了Nispex对小鼠的近似LD50,在此基础上以人急性髓系白血病细胞株HL-60为模型,研究了Nispex的体内外抑瘤效果及其与多柔比星联用的体内抑瘤效果,并探讨了其可能的抑瘤作用机制。用MTT法和集落形成实验检测了Nispex对HL-60细胞增殖的抑制活性。Nispex显着地抑制HL-60细胞增殖,表现出明显的量效关系和时效关系。药物作用48 h的IC50值为0.54μg/ml。集落形成实验表明Nispex对肿瘤增殖细胞群作用更为敏感。Nispex对正常人骨髓单个核细胞无抑制作用。体内抑瘤效果研究以HL-60裸鼠移植瘤为模型,连续给药14 d,以相对瘤体积和瘤重的变化来评估药物的抑瘤效果。Nispex 10 mg/kg/d瘤内给药按相对体积计算的抑制率(肿瘤生长抑制率)为59.4%,按瘤重计算的抑制率(抑瘤率)为45.3%(P<0.05);10 mg/kg/d腹腔给药的肿瘤生长抑制率为18.3%,抑瘤率为15.5%(P>0.05);30 mg/kg/d腹腔给药肿瘤生长抑制率为60.6%,抑瘤率为31.2%(P<0.05);Nispex 10 mg/kg/d腹腔给药与多柔比星15 mg/kg(尾静脉一次性给药)联用的肿瘤生长抑制率为94.4%,抑瘤率为92.9%(P<0.01)。进一步研究了Nispex与多柔比星联用的体内协同抑瘤效果,以药物相互作用指数(CDI)来评价药物联合作用疗效,判断标准:CDI>1,CDI=1和CDI<1分别表示两药拮抗,相加和协同,当CDI<0.7(P<0.05)时,表示协同作用非常显着。Nispex 10 mg/kg/d腹腔给药(连续给药9 d)与15 mg/kg多柔比星(尾静脉一次性给药,下同)联用对HL-60移植瘤有较好的抑制作用,抑瘤率89.0%,CDI为0.43(P<0.01),协同作用非常显着;与10 mg/kg的多柔比星联用抑瘤率为56.9%,CDI值为0.80(P<0.05),协同作用显着;与5 mg/kg的多柔比星联用抑瘤率为8.0%,CDI为1.51。病理检查各主要脏器无明显异常。Nispex对小鼠的近似LD50为126.81 mg/kg,主要表现为心脏毒性。采用AO/EB荧光染色、AnnexinⅤ-FITC/PI双标记流式细胞术检测、DNA倍体分析及细胞周期分析、TdT酶介导的原位缺口标记法和细胞DNA片段化检测证明Nispex对肿瘤细胞的杀伤作用主要表现为诱导细胞凋亡,研究结果还显示Nispex抑制HL-60细胞增殖主要是通过将细胞周期阻滞于G0/G1期。EMSA分析、Western Blot分析和免疫荧光分析显示Nispex是一种天然NF-κB抑制剂。Nispex的抗肿瘤活性可能与其抑制肿瘤细胞核中NF-κB的异常激活及抑制肿瘤细胞分泌VEGF有关。第叁部分研究了Nispex的广谱抗肿瘤作用。Nispex对小鼠肉瘤细胞株S180、小鼠黑色素瘤细胞株B16等4种鼠源肿瘤细胞株和小鼠胚胎成纤维细胞株3T3等均无细胞毒活性。而Nispex对所检测的人小细胞肺癌细胞株NCI-H446、人宫颈癌细胞株Hela、人T淋巴细胞白血病Jurkat、人急性早幼粒白血病细胞株NB4、人慢性粒细胞白血病细胞株K562、人T淋巴细胞白血病细胞株Molt4、人鼻咽癌细胞株CNE和人骨髓瘤细胞株U266等8种人源肿瘤细胞株均有较强的细胞毒作用,抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,表现出明显的量效关系和时效关系,其作用72 h时的IC50值在0.1~2.5μg/ml之间。对原代培养的慢性粒细胞白血病细胞也有良好的抑制作用,其作用72 h时的IC50值为2.48μg/ml。Nispex对有轻微致瘤性的人胚肾成纤维细胞株293T有抑制细胞增殖的作用,但未发现存在明显的量效关系,即使高达50μg/ml的浓度也不明显诱导其凋亡。细胞集落形成实验表明,与HL-60中的情况一样,Nispex对NB4和Jurkat中的增殖细胞群作用更为敏感。第四部分以培养的HL-60细胞为模型,比较了寄主分别为夹竹桃、桑树、无患子和桂花的红花桑寄生提取物的体外抑瘤效果。夹竹桃寄生抑制肿瘤细胞增殖的效果最好,桑树寄生抑制肿瘤细胞增殖的效果次之,无患子寄生又次之,桂花寄生在检测的浓度范围内基本无抑制作用。以上的研究证明,寄主为夹竹桃的红花桑寄生叶提取物Nispex是一种有效的抗肿瘤植物提取物,对人源肿瘤细胞有较好的选择性。与肿瘤化疗药物多柔比星联用有很好的协同效果。其抗肿瘤作用可能与其抑制肿瘤细胞核中异常激活的NF-κB活性和抑制肿瘤细胞分泌VEGF相关。
参考文献：
[1]. 槲皮素对小鼠T细胞行为的药理学作用[D]. 王南. 暨南大学. 2003
[2]. 菝葜提取工艺的改进及药理学研究[D]. 舒孝顺. 华中科技大学. 2005
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[4]. 槲皮素对LPS致小鼠胚胎着床障碍及子宫损伤的保护作用[D]. 杜西翠. 河北农业大学. 2014
[5]. 沙棘总黄酮抗栓作用机制及有效成分初探[D]. 程嘉艺. 辽宁中医药大学. 2008
[6]. 木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究[D]. 黄暨生. 广州中医药大学. 2016
[7]. 菝葜抑制α-葡萄糖苷酶活性成分的研究[D]. 袁杰. 湖北中医药大学. 2014
[8]. 五甲基槲皮素抗糖尿病大鼠肾脏纤维化的作用及机制研究[D]. 辛欣. 华中科技大学. 2013
[9]. 珠芽景天的鉴定、黄酮类成分含量测定及抗肿瘤活性研究[D]. 胡婧. 中南民族大学. 2012
[10]. 寄主为夹竹桃的红花桑寄生提取物（Nispex）的抗肿瘤作用及其成分研究[D]. 肖义军. 福建医科大学. 2007
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