陈秋菊[1]2004年在《衰老对人和小鼠睾丸精子发生影响及其机制的研究》文中研究说明目的 探讨衰老对人睾丸组织学结构与精子发生的影响，以及生精细胞增殖与凋亡的变化，分析衰老过程精子发生衰减的机制；借助老年小鼠模型探讨衰老对小鼠睾丸精子发生、附睾精子功能和受精的影响，为男性生殖衰老研究提供参考资料。 方法 1．老年人睾丸组织25例，根据年龄分为两组，A组54-69岁(n=12)和B组70-88岁(n=13)，以青年人睾丸组织(C组，n=8)作为对照组，应用光镜和透射电镜观察老年人睾丸组织结构，光镜下随机选择20个曲细精管横截面，分别计数支持细胞和各级生精细胞的数目，分析精子发生状况。应用TdT介导的原位缺口末端标记技术(TUNEL)检测睾丸生精细胞凋亡情况，应用免疫组化方法测定生精细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。 2．昆明系雄性小鼠，根据年龄分组：老年组为18月龄，对照组为6月龄，每组15只，分别取睾丸、附睾头精子和附睾尾精子，观察睾丸组织的增龄性变化，光镜下随机选择20个曲细精管横截面，分别计数支持细胞和各级生精细胞的数目，分析精子发生状况。检测附睾头和附睾尾的精子参数包括精子密度、存活率、活动率、正常形态率和胞浆小滴率，应用体外受精和早期胚胎培养实验评价老年小鼠精子受精能力和胚胎发育情况。 结果 1．老年人睾丸组织学显示部分曲细精管萎缩，生精功能低下，生精阻滞常见，主要发生在精子细胞和初级精母细胞阶段，可见未成熟生精细胞脱落到管腔。透射电镜观察到老年人曲细精管基膜增厚，支持细胞胞浆内有明显空泡，内质网疏松，溶酶体大而不规则，精子细胞染色质呈粗颗粒状，胞浆内线粒体肿胀。 2．老年人睾丸精子发生的定量分析显示老年A组和B组曲细精管横截面内暨南大学硕士学位论文衰老对人和小鼠翠丸精子发生影响及其机制的研究支持细胞平均数目均显着低于C组(尸<0.01)，A组和B组精原细胞与支持细胞的比值与C组相比均无显着差异(P>0.05)，B组初级精母细胞与支持细胞的比值低于C组(尸<0.05)，A组和B组球形精子细胞和延长精子细胞与支持细胞的比值均低于C组(P<0.001)。比较A组和B组各级生精细胞与支持细胞的比值，均未见显着差异(羚0.05)。 3.老年人B组肇丸生精细胞增殖指数(PI)显着低于C组和A组(尸<0.01)，B组翠丸生精细胞凋亡指数显着高于C组(P<0.01)，老年A组增殖指数与凋亡指数的比值(Pl/Al)与C组的比较没有显着差异(P>0.05)，B组PI/AI显着低于C组和A组(P<0.01)。 4.老年小鼠肇丸组织呈现部分曲细精管萎缩，生精功能低下。老年组曲细精管横截面内，支持细胞数目与对照组的比较没有显着差异(尸>0.05)，精原细胞和初级精母细胞与支持细胞的比值与对照组比较均无显着差异(尸>0.05)，球形精子细胞和延长精子细胞与支持细胞的比值均低于对照组(P<0.01)。 5.老年小鼠附翠头的精子密度、活动率和胞浆小滴率均显着低于对照组 (P<0.01)，精子存活率和正常形态率与对照组相比未见显着差异(P>0.05)。老年小鼠附翠尾精子密度、活动率和正常形态率均低于对照组(p<0.05)，体外受精率显着低于对照组(尸<0.001)，且受精后胚胎发育率降低(P<0.01)。 结论 1.老年人肇丸组织显示出增龄性结构改变，表现为曲细精管内支持细胞数目减少，精原细胞未减少，初级精母细胞及其后阶段的精子细胞明显减少，表明老年人翠丸精子发生是衰减的。 2.老年人辜丸生精细胞增殖减少，凋亡增加，增殖与凋亡的比值降低，这种改变明显存在于高龄组(70一88岁)，说明增殖与凋亡的平衡改变是老年人精子发生衰减的可能机制之一。 3.老年小鼠翠丸组织呈现增龄性结构改变，翠丸曲细精管的精子发生降低。老年小鼠附辜头和附辜尾的精子数量和精子功能下降，受精能力降低，反映出衰老影响小鼠翠丸精子发生和附翠精子成熟过程。
贾文文[2]2010年在《人端粒酶在小鼠体内和iPS细胞中的表达调控》文中研究指明端粒酶活性和端粒长度在人和小鼠之间存在着明显差异,因此,端粒酶的调控具有物种问的特异性。这些不同导致小鼠和人在衰老和癌症发生上的本质区别。为了探讨这些生物学过程的基本机制,本论文研究了在转基因模型中人和小鼠端粒酶的发育沉默和它们在小鼠乳腺癌模型中的活化,以及在发生核重编程的诱导多能干细胞中的活化。本研究结果表明hTERT基因在胚胎发育过程中被沉默,但在乳腺癌细胞和诱导多能性过程中被高度激活。另一方面,小鼠的mTERT基因在大部分成体组织和体细胞中有高水平的表达。由于端粒的延长在人干细胞的自我更新和分化潜能上具有关键性的作用,我们的发现对iPS细胞的产生和应用有着重要的指导意义。本论文分叁个研究部分。1.人端粒酶在转基因小鼠体内的发育和肿瘤发生中的调控将含hTERT基因的细菌人工染色体(BAC,158kb)导入小鼠,获得了转hTERT-Rluc基因的小鼠。在BAC的hTERT基因启动子下游插入海肾荧光素酶(Rluc),通过定量分析小鼠体内Rluc的活性,研究hTERT在小鼠各组织和器官中的表达调控。转基因hTERT (hTERT-Rluc)和小鼠内源mTERT的表达量在大多数组织中随着胚胎的成熟发育逐渐减少,而hTERT-Rluc表达在小鼠胸腺、睾丸和卵巢组织发育中逐渐增加或保持在较高水平。此外,在小鼠肿瘤发生过程中hTERT-Rluc的表达量也明显增加,但是小鼠内源的mTERT表达量则没有明显变化。这些结果表明,在转基因小鼠中hTERT-Rluc的表达调控方式与在人体内的调控方式相类似,而明显与小鼠内源mTERT的表达调控不同,从而证实TERT基因调控的特异性取决于种间基因序列的不同。该转基因小鼠模型的建立有利于hTERT基因相关疾病机理及药物筛选的研究。2.端粒酶在诱导多能干细胞中的激活从转hTERT-Rluc基因的小鼠上获得成纤维细胞,诱导得到叁个不同重编程阶段的miPS细胞系,将这些细胞系与hiPS细胞系作比较,发现在miPS和hiPS细胞中,hTERT高度激活,但是内源mTERT基因表达量与诱导前成纤维细胞相比增加不明显。因此,本章主要研究了人iPS细胞端粒酶的表达调控。研究中发现不同hiPS克隆之间hTERT和端粒酶活性表达差异显着,而且大多数hiPS细胞克隆端粒长度的增加需要经过体外多次传代培养,仅具有高端粒酶活性的hiPS细胞其端粒长度与人胚胎干细胞的相同。当hiPS细胞经类胚体诱导分化为成纤维样细胞时,端粒酶活性降低,端粒长度迅速减少。本研究结果显示端粒酶基因在人和小鼠细胞不同重编程阶段的激活存在差异。由于端粒在iPS细胞自我更新和分化潜能上起着重要作用,我们的发现对诱导多能干细胞产生和应用有着重要的指导作用。3.高表达TERT和TERC对人和小鼠成纤维细胞的影响端粒酶的核心成分包括端粒酶逆转录酶TERT和端粒酶RNA组分TERC。在人成纤维细胞(NHF)和小鼠成纤维细胞(MEF)中分别表达TERT、TERC和共表达TERT/TERC,通过实时定量PCR进行定量检测,并采用TRAP和Southern blot技术分析转染细胞中端粒酶活性和端粒长度的变化。结果显示hTERT在NHF细胞中可以激活端粒酶活性,延长端粒长度,而hTERT和hTERC组合更有利于端粒酶的激活,增加端粒长度。但是不论人或者小鼠的TERT, TERC或者TERT/TERC组合均在MEF细胞中不能激活端粒酶活性。在NHF细胞中,高表达hTERT/hTERC基因比高表达hTERT/mTERC基因激活的端粒酶活性强,说明TERC成分的种间特异性决定了端粒酶活性的高低。在NHF细胞中,高表达mTERT/hTERC激活的端粒酶活性与高表达hTERT/hTERC中的基本一致,但端粒长度却较高表达hTERT/hTERC的NHF细胞中短,说明TERT成分的种间特异性决定了端粒长度的增加。上述结果表明TERT和TERC的组成成分在种间的特异性决定了端粒酶的活性和端粒的长度。
参考文献：
[1]. 衰老对人和小鼠睾丸精子发生影响及其机制的研究[D]. 陈秋菊. 暨南大学. 2004
[2]. 人端粒酶在小鼠体内和iPS细胞中的表达调控[D]. 贾文文. 西北农林科技大学. 2010