褚艳[1]2003年在《海洋假别单胞菌CY24的琼胶酶基因的克隆、重组表达及酶学性质研究》文中研究表明随着糖生物学和化学研究的发展，近几年来人们发现不同聚合度的琼胶寡糖具有重要的药用价值，如抗肿瘤、抗感染、抗氧化等，有望发展为新一代海洋药物和功能食品，具有强大的市场竞争力和广阔的发展前景。传统的琼胶寡糖制备方法是琼胶的化学稀酸水解法，该方法的裂解产物分子量不均一，难以得到足量的低聚糖纯品。而琼胶酶降解底物的专一性强，有利于单一低聚糖的制备。然而目前已发现的琼胶酶不但活性低，而且产物特异性较差，成为制约琼胶寡糖构效关系和应用研究的瓶颈因素。因此，高活性、高特异性的琼胶酶的发现具有重要理论意义和广阔应用前景。 本论文利用琼胶作为唯一碳源的选择性培养法从海水中分离得到1株高产琼胶酶的菌株，通过形态观察、生理生化实验以及16SrRNA序列分析，鉴定该菌株属于假别单胞菌属(Pseudoalteromonas)，命名为假别单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)CY24。经发酵条件优化确定最适培养基配方为(w/v)：NaCl 2.5％、干酪素0.25％、MgSO_4·7H_2O 0.5％、KCl 0.1％、FeSO_4·7H_2O 0.002％、CaCl_2 0.02％、NaH_2PO_4 0.06％、琼胶0.25％、pH7.0。最佳培养条件为25℃培养24h，优化后粗酶液的酶活最高可达1.8U/ml，较优化前提高了20倍。 利用鸟枪法从Pseudoalteromonas sp.CY24中克隆到1个琼胶酶基因(agaA)。首先提取Pseudoalteromonas sp. CY24的基因组DNA，分别利用PstⅠ和HindⅢ进行条件性酶切，回收2.5-7.0 kb的DNA片断，重组于pBlueseriptⅡKS(+)载体转化Escherichia coli DH5α，建立基因组文库。利用琼胶唯一碳源培养基结合蓝白斑筛选得到9株具有琼胶酶活性的阳性重组子，对其中1株的重组质粒pA5进行测序，测序结果表明，pA5中插入了包含琼胶酶基因在内的共3.5kb的外源片断。根据生物信息学分析和亚克隆的建立，确定了琼胶酶基因的开放阅读框架为1359bp。用DNATools分析软件得到的该琼胶酶的一级结构共含氨基酸453个，分子量为50.8kDa，pⅠ值为6.07。agaA基因的序列分析表明：在起始密码子上游具有SD序列及启动子序列中较为保守的-10区和-35区，在翻译的终止密码子下游25个碱基处出现9个碱基的反向重复序列，形成发夹结构的自有能为-12.9kcal，具有典型的不依赖于p因子的终止子的序列特征。用SignalP在线分析软件对agaA翻译产物N端的前50个氨基酸进行信号肽预测，发现前23个氨基酸具有信号肽的特征，蛋白质合成后，通过在23位和24位氨基酸之间进行切割而形成最终的成熟蛋白。用CLASTALW系统对该琼胶酶与其它已知琼胶酶进行氨基酸序列同海洋假别单胞菌cY24的琼胶酶基因的克修、重组表达及酶学性质研究源性分析，并未发现有显着相似性的序列(序列一致性不大于40%，序列相似性不大于75%)，证明本文克隆的雌喇是一种新的琼胶酶基因。该序列已提交GenBank，登录号为AYI 50179。 利用pET一24a(+)质粒构建了日gaA基因表达载体，在表达产物c末端融合了6个组氨酸的标签(6 X His·Tag)。利用化学转化法将构建的琼胶酶表达载体转入E.coli BL21(DE3)表达宿主中，筛选阳性克隆扩大培养，通过IPTG诱导，菌体中出现了大量诱导表达的重组蛋白，超声波破碎上清液有明显的琼胶酶活性。经镍离子柱分离纯化后，SDS一PAGE检测为单一条带，说明已达到电泳纯。重组琼胶酶的理化性质与根据氨基酸序列的理论推测值基本一致。 重组琼胶酶的基本酶学研究表明，酶的最适pH为6.5，pH稳定范围较大(4一10);最适温度为40℃，在40℃以上时酶活力迅速衰减;最适底物琼脂糖浓度为0.25%。利用TLC法(Thin Layer chromat。孚aphy)对酶与底物的作用方式进一行研究，结果表明琼胶酶特一性地降解琼脂糖的半乳糖交联结构中的p(l一4)糖昔键，属p一琼胶酶。利用队eE(Fluorophore一assistede砒。场drate electroPhoresis)技术对酶解琼脂糖得到的低聚糖组分进行分析，发现酶解的最终产物主要为新琼四糖和新琼六糖，并且四糖和六糖的含量大于90%。 综上所述，本论文利用现代分子生物学的最新技术，从海洋假别单胞菌CY24中克隆并重组表达了一种新的琼胶酶基因，酶学性质研究表明该酶具有高活力和高底物专一性，为高纯度琼胶寡糖的大量制备创造了条件，为琼胶寡糖的基础和应用研究提供技术支撑，满足人类日益增长的需求。为海洋寡糖类创新药物的研究开发以及相关产业的发展奠定新的技术方法学基础，对推动糖生物学和化学研究的深入开展具有重要意义。
马怡茗[2]2007年在《新型β-琼胶酶AgaB的定向进化》文中研究表明琼胶酶AgaB是本试验室从海洋假别单胞菌CY24中克隆得到的一个新颖的胞外琼胶酶。研究表明AgaB是一个结构和功能全新的β-琼胶酶,降解琼脂糖的主要产物为新琼八糖和十糖,最小底物为十二糖,作用机制为倒位型,在家族划分上该酶不属于任何一个已知的糖苷水解酶家族,这些都不同于已发现的其它琼胶酶。AgaB结构上的新颖性和功能上的特异性决定了它在工业和药用方面拥有潜在的应用价值。但是AgaB较低的温度稳定性(在高于35°C的情况下容易失去酶的活性)限制了它在工业上的更大规模的应用。实验室前期工作建立了耐热性明显提高的突变株M446,但其催化活性相比于野生型下降了20%。本论文旨在通过定向进化的方法,在保持M446耐热性的前提下提高其催化活性。定向进化的两个关键步骤是建立分子的多样性文库和高通量筛选体系。本文采用易错PCR和化学诱变来建立分子的多样性,以组成型表达载体pBS-ks(sv)作为载体建立突变体文库。易错PCR引起的碱基突变多发生在胸腺嘧啶和腺嘌呤位点,而化学诱变剂甲基磺酸乙酯主要引起鸟嘌呤位点的突变,在一定程度上弥补了易错PCR的不足。根据琼胶酶水解琼胶引起琼胶液化在平板上产生透明水解圈,而且相对酶活较高的突变株在平板上形成较大的水解圈的特性建立了高通量筛选体系。突变菌株在37°C下过夜培养,筛选水解圈/菌落克隆直径大于野生型菌的克隆,作为研究对象进行发酵液上清和纯酶水平上的进一步鉴定。最终我们获得了一个热稳定性和产物性质没有改变而比活力为M446 3倍的突变株,命名为M117。测序结果表明,M117发生了四处碱基替代,其中两处引起了氨基酸替代,分别是Arg9→Lys,Ile111→Val,另两处为无义突变。其中第9位的氨基酸突变存在于信号肽区域,该区域在蛋白质跨膜转运的时候被切除,对成熟酶的比活力没有影响,由此,可以推断引起突变株M117比活力提高的主要原因是第111位氨基酸的突变。为了推测突变株M117催化活性提高的机制,我们分别测定了M117与M446的动力学常数,结果表明,突变株M117的Km值比M446降低了14倍,而其Kcat值变化不明显。由此可以推断,突变株M117催化活性提高的主要原因是酶与底物的结合能力增强。实验中发现的氨基酸替代为缬氨酸替代了异亮氨酸,二者均为疏水性氨基酸,但是缬氨酸的侧链基团比异亮氨酸的小,推测第111位的氨基酸可能位于底物结合位点附近或者属于底物结合位点的一部分,而短的侧链基团对底物进入催化腔的空间位阻比较小,有利于底物与底物结合位点的结合。另一方面,因为异亮氨酸与缬氨酸的性质比较类似,所以这种替换没有造成突变株M117其它性质的改变。综上所述,应用定向进化方法,我们得到了一个既保持了耐热性和产物特性,又提高了催化活性的突变株M117。其进一步提高的催化活性,将会使突变株M117在食品、化妆品和医药方面得到更大规模的应用。此外,由于序列和结构的新颖性,使得AgaB叁维结构的确定非常困难,而突变株M117的获得对于确定AgaB的结构具有重要的指导意义。
张立[3]2006年在《新型β-琼胶酶工程菌株的构建、重组表达及体外复性的研究》文中指出琼胶酶(Agarase)是能够降解琼胶的水解酶,根据其作用方式不同,可以把琼胶酶分为两类:α-琼胶酶和β-琼胶酶。α-琼胶酶裂解琼脂糖的α-1,3糖苷键,生成以3,6-内醚-α-L半乳糖为还原性末端的的琼寡糖系列;β-琼胶酶裂解琼脂糖的β-1,4糖苷键,生成以β-D-半乳糖为还原性末端的新琼寡糖系列。目前所发现的琼胶酶中,大多数都是β-琼胶酶,只有叁种是α-琼胶酶。现今琼胶酶已广泛应用于食品、化妆品、医药行业以及基础研究领域,其生理功能越来越引起人们的关注。本实验室已从一株假别单胞菌CY24(Pseudoalteromonas sp. CY24)中克隆了一个新型β-琼胶酶AgaB,并且在E.coli中已重组表达了agaB基因。研究表明AgaB是一个结构和功能全新的β-琼胶酶,它属于一个新的糖苷水解酶家族。AgaB不同于已报道的琼胶酶(降解琼脂糖的主要终产物是新琼二糖、四糖或六糖),它降解琼脂糖的主要终产物是新琼八糖和十糖,因此琼胶酶AgaB将会在食品、化妆品、医药等行业以及生物技术研究领域发挥更大的应用潜力。重组AgaB在pET24/BL21 (DE3)的表达系统中大部分为不可溶的包涵体形式,只有少量可以分泌到发酵上清液,分泌到上清液中的目的蛋白需经过硫酸铵沉淀、脱盐、离子交换、疏水层析、分子筛等系列纯化步骤,最终可以从1L发酵上清中分离得到2-3 mg纯蛋白,鉴于AgaB在该表达系统中纯化步骤多,诱导剂价格昂贵,耗时长(16小时)不利于大规模生产等特点,本文采用了温度控制型载体pBV220作为表达载体,为了方便纯化,分别在AgaB的N端和C端添加了六个组氨酸作为亲和层析纯化标签构建了两种重组子,经过比较其在不同宿主中的表达量,选定BL21(DE3)为其宿主菌。重组AgaB在42℃诱导4小时即可达到最高表达量,主要以包涵体的形式存在。菌体经过超声破碎、Triton X-100、DOC洗涤后得到高纯度的包涵体,包涵体用8molL-1的尿素溶解,经过镍离子亲合柱一步纯化得到大于95%纯度的目的蛋白,目的蛋白经脉冲稀释法进行复性,最终从1L发酵液中得到了40mg活性
吴倩倩[4]2008年在《琼胶酶β-AgaA结构和功能关系的研究》文中认为糖水解酶是糖生物学研究的前沿和热点。琼胶酶是一种糖水解酶,在医药、食品等多个领域具有广泛的应用前景。因此,琼胶酶的研究具有重要的理论意义和应用价值。本实验室从一株海洋假别单胞菌CY24中克隆了一种新的胞外琼胶酶β-AgaA,序列分析显示它属于糖苷水解酶家族GH16。然而,与GH16家族其它琼胶酶不同,首先,β-AgaA水解琼脂糖的主要产物为新琼四糖、六糖及少量二糖;其次,虽然β-AgaA的最小底物为新琼八糖,但其作用模式有两种。因此,无论是降解终产物的特异性还是最小底物的降解模式β-AgaA均具有独特性。为了阐明β-AgaA结构与功能关系,本论文通过序列比对、结构模拟、定点突变等技术对β-AgaA中的一些关键位点进行了分析和探讨。首先,利用生物信息学方法分析了琼胶酶β-AgaA在家族内结构上的共性和特异性。从GenBank数据库中搜索所有的琼胶酶的基因序列或者氨基酸序列,首先利用ClustalW、BioEdit等软件进行比较,结果表明GH16家族的琼胶酶在一级结构上同源性非常低;进而我们将104Y作为模板,利用Espript、HCA等软件进行比对,分析显示GH16家族在二级结构上存在较高的同源性,预示着它们在叁级结构上也具有相似的折迭模式。根据以上结构我们使用SWISS-Model、SYBYL-FUGUE软件等进行同源建模,构建了琼胶酶β-AgaA的分子模型;用AutoDock、Ligplot等软件建立了β-AgaA和新琼寡糖底物之间的对位信息,结合一级和二级结构上的同源性分析,推测H71、F185、N103、S182、TH189-190、VVTS109-112等位点可能对酶的催化活性或催化机制有影响作用。为了验证以上位点对酶活性或催化特性是否影响,我们利用定点突变构建了相关位点的突变株并进行了验证。定点突变分别采用了大引物PCR法和Quikchange试剂盒,构建的六个突变体包括:H71N,F185L,N103T,S182I,TH189-190AA和VVTS109-112GCHL。经过重组表达、分离纯化和酶活测定,结果表明TH189-190AA和VVTS109-112GCHL的突变导致了β-AgaA活性几乎全部丧失;而F185L的突变会引起酶活性部分丧失;其他叁个突变体活性较野生型无明显差异。进一步经过结构模拟和Ligplot软件分析,我们推测酶与底物结合的-4位点H71和底物之间形成的氢键作用比较弱,所以对酶与底物的亲和没有太多影响,而TH189-190和VVTS109-112可能均位于催化腔中,改变其疏水性和氨基酸侧链后可能导致酶无法与底物结合,从而使酶活丧失。荧光辅助碳水化合物电泳(FACE)法对突变体酶降解琼脂糖的产物进行了分析,结果表明所预测的突变体均不能改变降解模式,终产物仍然是新琼六糖和新琼四糖。由此我们得出:这些位点的改变不能改变催化腔的结构,因此产物性质没有发生改变。本论文利用生物信息学和定点突变的方法研究了琼胶酶β-AgaA的结构和功能关系,揭示了酶与底物的对位对酶催化活性和作用方式的影响,对琼胶酶甚至糖苷水解酶构效关系研究的深入开展具有指导意义。
林伯坤[5]2008年在《海洋细菌HZ105和ZC1产琼胶酶的研究》文中研究说明海洋微生物酶的开发和利用是实现海洋资源高值化的关键技术之一。琼胶酶(agarase)是可以将琼胶(琼脂)降解为琼胶寡糖的酶。不同聚合度的琼胶寡糖已被发现具有越来越多的生理功能活性,生产系列琼胶寡糖也成为了琼胶酶的一个主要应用。此外,琼胶酶还可以用于琼脂糖电泳中的核酸回收、制备海藻细胞原生质体、筛选信号肽序列等。目前的琼胶酶主要来自海洋细菌。本论文首先采集汕头海域表层沉积物和富含琼胶的紫菜藻体样品,从中筛选得到两株高产琼胶酶的海洋细菌HZ105和ZC1。通过对菌株的常规特性分析和分类鉴定,菌株HZ105归属于Agarivorans,命名为Agarivorans sp.HZ105。而16SrDNA序列分析结果,同时结合细胞形态、全细胞脂肪酸组分、碳源利用、部分生理生化性质、基因组GC含量等分析表明,菌株ZC1应作为标准菌株建立一个新属,其中菌株ZC1是一株代表新种的菌株。进一步研究了培养时间、培养基pH和NaCl浓度对两菌株生长和产琼胶酶的影响。其中菌株HZ105在pH7-10、NaCl浓度为1-3%范围内培养16h产琼胶酶最好,说明菌株HZ105偏好碱性环境生长,其所产琼胶酶也可能耐碱性。此外,菌株HZ105的胞外琼胶酶粗酶液在室温存放2天后还能保持90.9%的酶活力。而菌株ZC1在pH7-8、NaCl浓度为2-3%范围内产琼胶酶最好;但ZC1的营养需求比较特别,只能利用Biolog系统的GN2板95种碳源中葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、淀粉、糊精等少数碳源。不过菌株ZC1的琼胶酶不是只由琼脂诱导产生,这也是其独特之处,使运用廉价的碳源生产琼胶酶成为可能。采用从聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶回收蛋白的方法分离纯化了菌株HZ105的叁个胞外琼胶酶,并通过SDS-PAGE电泳测得了其分子量54kDa、58kDa、105kDa,接着运用串联质谱技术鉴定了该叁个琼胶酶,发现这叁个酶均为β琼胶酶,属于糖基水解酶50家族。根据琼胶酶的串联质谱结果和Genbank中已报道的相关琼胶酶基因信息,设计引物,通过PCR技术从菌株HZ105中克隆了一段分子量约为105kDa的琼胶酶的编码基因,成熟蛋白编码序列长2931bp,将该基因序列比对NCBI的CDD保守区数据库,未搜索到保守区,说明其可能存在新的活性催化部位。将该基因与pET-32a(+)构建重组表达载体,转化大肠杆菌,初步探索了琼胶酶基因的重组表达。
李京宝[6]2004年在《重组β-琼胶酶的制备与应用》文中研究表明随着糖生物学研究的开展，寡糖的重要生理活性和药用价值逐渐被人们所发现，而琼胶寡糖的抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用备受关注，有望成为新一代的海洋药物和功能食品。在琼胶寡糖制备方面，酶解法较其他方法有着底物专一性强、产物特异性高、反应条件温和等优点，有利于高纯度寡糖的大量制备。因此，高效琼胶酶的发现与规模化制备具有重要理论意义和明确的应用前景。本论文旨在建立两种高活力、高特异性的β-琼胶酶AgaA和AgaB大规模制备的技术平台，并利用这两种酶制备系列高纯度新琼寡糖。主要研究内容如下： 1．转基因菌株最佳产酶条件的建立 通过设计了L_9(3~4)正交试验，从诱导温度、诱导时间、IPTG浓度、DOC浓度四个方面对产β-琼胶酶的转基因工程菌株BL21-pET24-agaA和BL21-pET24-agaB的表达条件分别进行了优化，最终确定BL21-pET24-agaA的最佳产酶条件为25℃，16 h，0.1 mM IPTG，0.01％ DOC，发酵液酶活性提高5.3倍；BL21-pET24-agaB的最佳产酶条件为25℃，24 h，0.1 mM IPTG，0.001％DOC发酵液酶活性提高近10倍。 2．琼胶酶的分离纯化 在优化了表达条件的基础上，利用快速蛋白质液相色谱纯化系统(FPLC)对两种β-琼胶酶分别进行了纯化。AgaA经过硫酸铵沉淀、疏水层析、凝胶过滤层析叁步纯化，最终纯化342倍，活性回收率28.04％。AgaB经过硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析四步纯化，最终纯化476倍，活性回收率29.5％。经SDS-PAGE检验，纯化后的两种酶都己达到电泳纯。 3．系列高纯度新琼寡糖的制备 利用纯化的两种琼胶酶分别建立了高产不同聚合度新琼寡糖的最佳琼脂糖酶解体系。AgaA降解琼脂糖得到新琼寡糖的产率为74％，其中新琼四糖占47％，新琼六糖占45％；AgaB降解琼脂糖得到新琼寡糖的产率为81％，其中主产物新琼八糖占36%、新琼十糖32%、新琼十二糖16.7%。继而用分子筛Bio--Ge1P一2Fine和Bio一GelP一6 Fine对分子量范围不同的寡糖产物进行了纯化，使之纯度达到95%以上。纯度和聚合度用薄层层析(TLC)和荧光辅助碳水化合物电泳(FACE)进行了分析。 4.系列新琼寡糖的结构确证 在得到纯度较高单体的基础上，又利用基质辅助激光解吸一飞行时间质谱(撇LDITOF一MS)、红外光谱(IR)和核磁共振碳谱(‘3C一NMR)对系列新琼寡糖进行了结构的确证。MALDITOF书S结果均显示较强的〔M+Na]’及〔M+K]’金属分子离子峰，所得分子量分别为630(新琼四糖)、936(新琼六糖)、1242(新琼八糖)、1548(新琼十糖)和1854(新琼十二糖)。五种新琼寡糖的IR谱图的吸收峰数、位置和峰形基本相似，并与琼脂糖的图谱相似，表明琼胶酶在降解琼脂糖的同时，并没有对其结构产生重大的破坏作用。最后’3c一NMR结果中97 pPm和93pPm的化学位移作为还原端半乳糖c1位Q和p异头碳的特征峰，更证明了所得系列寡糖为新琼寡糖无疑。 本论文建立了两种p一琼胶酶的制备工艺，并利用这两种酶建立了系列高纯度新琼寡糖制备的技术平台，解决了新琼寡糖制备的技术难题，实现了系列高纯度新琼寡糖的大规模制备，为海洋寡糖类创新药物、功能食品等生物制品的研究与开发奠定了基础:并首次提供了新琼八糖、十糖和十二糖标准品，填补国际市场上的空白。
参考文献：
[1]. 海洋假别单胞菌CY24的琼胶酶基因的克隆、重组表达及酶学性质研究[D]. 褚艳. 中国海洋大学. 2003
[2]. 新型β-琼胶酶AgaB的定向进化[D]. 马怡茗. 中国海洋大学. 2007
[3]. 新型β-琼胶酶工程菌株的构建、重组表达及体外复性的研究[D]. 张立. 中国海洋大学. 2006
[4]. 琼胶酶β-AgaA结构和功能关系的研究[D]. 吴倩倩. 中国海洋大学. 2008
[5]. 海洋细菌HZ105和ZC1产琼胶酶的研究[D]. 林伯坤. 汕头大学. 2008
[6]. 重组β-琼胶酶的制备与应用[D]. 李京宝. 中国海洋大学. 2004
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