第一部分：APC/C-CDH1调控的TCA循环代谢酶IDH3β促进细胞生长的机制研究 第二部分：肿瘤抗原在食管鳞癌进展中的作用及分子机制研究

论文摘要

细胞分裂是由一系列精密调控的事件组成,而胞内代谢水平与细胞的生存状态紧密相关,因此细胞分裂的不同阶段会引发不同的代谢变化。E3泛素酶后期促进复合物（Anaphase-promoting Complex,APC/C）作为细胞周期重要的中心调控机制,与其共激活因子CDH1和CDC20共同催化周期相关蛋白及时降解,以保证细胞顺利分裂。然而,APC/C不仅调控细胞周期,还被发现能作用于PFKFB3以及GLS1,进而调控肿瘤细胞的糖酵解途径和谷氨酰胺代谢途径,提示APC/C具有连接细胞周期及肿瘤代谢的作用。本课题在2752个代谢酶和转运体中筛选同时含有APC/C结合序列KEN box和D box且在食管鳞癌测序数据中拷贝数变异频率超过20%的基因,得到17个可能受到APC/C调控的酶和转运体。由于APC/C对TCA循环的调控尚未被发现,而我们在食管鳞癌细胞中观察到三羧酸（Tricarboxylic acid cycle,TCA）循环的代谢产物α-酮戊二酸（α-ketoglutarate,α-KG）、延胡索酸及苹果酸与S期具有正相关关系,暗示了细胞周期与TCA循环的潜在联系。因此我们在17个候选蛋白中挑选TCA循环重要的限速酶异柠檬酸脱氢酶3（Isocitrate Dehydrogenase,IDH3）之一的亚基IDH3β作为对象,研究细胞周期对TCA循环的调控作用。我们首先采用Co-IP验证了 IDH3β能够与APC/C发生结合,然后采用不同的周期同步化方法观察到IDH3β具有周期依赖性表达,即IDH3β的蛋白水平在G1后期逐渐积累,在S早期达到最高。通过该现象,我们又采用Co-IP技术以及PLA原位结合技术确定对IDH3β调控的APC/C共激活因子,发现CDH1在G1早期与IDH3β结合,并在G1期作为IDH3β的主要调控因子。此外,IDH3β在APC/C-CDH1的介导下能够发生泛素化降解,当突变结合序列KEN box和D box之后,APC/C-CDH1则无法对突变体进行调控。我们随即对IDH3β的生物学功能进行了研究,采用流式细胞技术以及EDU染色技术,发现IDH3β具有促进细胞G1/S期转换的功能。进一步实验发现,IDH3β能够促进细胞增殖,增强克隆形成能力以及促进裸鼠皮下成瘤,提示IDH3β能够促进食管鳞癌细胞的恶性表型。由于IDH酶是TCA循环的重要限速酶,我们检测到IDH3β亚基能够提高胞内的α-KG、延胡索酸及苹果酸的水平,并且IDH3α和IDH3y亚基也能够上调胞内的α-KG、延胡索酸及苹果酸的水平并促进G1/S期的转换,说明IDH3β作为IDH3亚基能够促进TCA循环的氧化代谢。既然IDH3β能促进生长并且提高底物α-KG的水平,我们通过回补实验发现IDH3β能部分依赖α-KG促进细胞G1/S期转换以及细胞生长。其次,我们还发现IDH3β能提高细胞对葡萄糖的摄取能力,并且上调PFKFB3的表达促进其入核。最后,我们通过免疫组化方法在含有340对人食管鳞癌组织、对应癌旁组织和淋巴结转移组织的芯片中检测IDH3β的表达情况,发现IDH3β在转移的淋巴结组织和癌组织中的含量均高于癌旁组织（P<0.001）,并且IDH3β的高含量与病人的低生存率（包括总生存和无病生存）显著相关（总生存:P=0.011,无病生存:P=0.038）。多变量Cox回归生存模型分析表明IDH3β在总生存中可以作为独立的生存预后因素（总生存:P=0.029,HR=1.484,95%CI:1.041-2.142）。综上所述,本课题发现受到APC/CDH1调控的IDH3β能够通过其催化产物α-KG加快细胞G1/S转换而促进生长,首次揭示了连接TCA循环和细胞周期的双向调控分子机制。本研究还发现IDH3β能促进TCA循环的氧化代谢且对糖酵解关键酶PFKFB3存在调控。最后,IDH3β在食管鳞癌组织及转移的淋巴结组织中高表达,并且与表达量与患者的生存预后显著相关。食管癌是一种常见的消化道肿瘤,超过一半的食管癌发生在中国且食管鳞状细胞癌（简称食管鳞癌）（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC）是主要病理学亚型。由于食管鳞癌极易转移、复发频率也很高,患者即使接受手术联合放化疗的治疗后,仍无法获得良好的预后效果。为了更好地了解食管鳞癌发生和进展的机制,我国迄今为止进行了多项食管鳞癌的全基因组测序分析,共同描绘了食管鳞癌患者基因组改变的情况。这些分析帮助我们全面了解食管鳞癌的发病机制,为改善诊断和提高疗效提供有效的切入点。本课题组前期通过全基因组测序（Whole Genome Sequencing,WGS）、全外显子测序（Whole Exome Sequencing,WES）和比较基因基因组杂交技术（Comparative Genomic Hybridization,CGH）对食管鳞癌患者基因组进行了深入地分析,发现肿瘤抗原MAGE-C3基因具有8.0%的突变率以及8.6%的拷贝数扩增率,提示我们MAGE-C3可能在食管鳞癌的发生发展中发挥重要作用。此外,我们通过公共数据库发现MAGE-C3在多种癌症具有突变和拷贝数扩增的现象,喑示MAGE-C3可能在多个癌种中发挥功能。因此,我们以MAGE-C3为研究对象,采用免疫组化方法在食管鳞癌组织及其邻近正常组织中检测MAGE-C3的蛋白水平。结果显示:癌组织中的MAGE-C3水平明显高于癌旁组织（P<0.001）,同时,MAGE-C3表达水平高的患者表现出更差的预后情况（P=0.042）。此外,我们在分析MAGE-C3的表达水平与临床指标的关系时,发现MAGE-C3的表达水平越高,肿瘤病理分级也越高（P=0.011）,发生淋巴结转移可能性也越大（P=0.034）,这些结果提示我们MAGE-C3可能具有重要的临床意义。在探讨MAGE-C3对食管鳞癌细胞恶性表型的作用中,我们发现MAGE-C3并不影响肿瘤细胞的生长,但却能够促进肿瘤细胞的侵袭及迁移功能,裸鼠尾静脉注射实验中同时也发现MAGE-C3能够提高肿瘤细胞肺转移的能力。为了更深入地了解MAGE-C3在肿瘤细胞中的功能,我们对稳定高表达MAGE-C3的细胞系及其对照细胞系进行转录组测序,并筛选两个样本之间的差异表达基因。通过GO分析我们观察到,过表达MAGE-C3引起差异表达的基因主富集在干扰素（Interferon，IFN）通路。由于II型IFN即IFN-γ在肿瘤中参与重要的免疫调节过程,因此我们将探究MAGE-C3对肿瘤细胞的IFN-γ通路产生的影响。我们首先在食管鳞癌细胞系中选择了对IFN-y较为敏感的KYSE30细胞系,并且发现KYSE30对IFN-γ具有浓度和时间依赖性。根据上一步结果,我们采用最佳的IFN-γ作用浓度和时间（20ng/ml,24h）在KYSE30中探究MAGE-C3对IFN-y通路的作用。实验结果显示:在IFN-γ诱导的情况下,过表达MAGE-C3能明显增加STAT1的701位点磷酸化水平以及包含IFN-γ特有激活位点（Gamma Activation Site,GAS）元件的荧光素酶报告质粒的荧光活性,与IFN-γ协同地提高了经典的IFN-γ/JAK/STAT1通路的激活水平。此外,MAGE-C3可以上调IFN-γ通路下游蛋白PD-L1的mRNA水平和膜表面水平。在上述结果中MAGE-C3能够影响参与免疫调控的IFN-γ通路,因此我们将活化后的健康人外周血淋巴细胞与稳定敲降MAGE-C3的食管鳞癌细胞共培养,并采用流式检测淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤情况,发现共培养后稳定敲降MAGE-C3的细胞凋亡增多,说明MAGE-C3具有保护肿瘤细胞不被淋巴细胞杀伤的作用。我们还将稳定敲降MAGE-C3的食管鳞癌细胞与活化的Jurkat T细胞共培养,采用ELISA检测培养液上清细胞因子水平,发现具有免疫促进功能的TNF-α,及IFN-γ含量上升,而具有免疫抑制功能的IL-10,IL-1β含量下降,说明MAGE-C3可以影响T细胞因子分泌。为了进一步探究MAGE-C3在具有正常免疫机能环境下的作用,我们在黑色素瘤小鼠细胞系B16F10中稳定高表达MAGE-C3,并对免疫系统完全的C57BL/6J小鼠进行尾静脉注射,发现高表达MAGE-C3 可以提高肿瘤细胞的肺转移能力。接着,我们采用免疫组化的方法以及组织分离单细胞染色流式检测的方法,对小鼠肺转移灶中的肿瘤浸润淋巴细胞进行分析。结果,我们在注射了高表达MAGE-C3细胞的肺部中,观察到CD8+T细胞占总T细胞的比例降低（P=0.038）,PD-1+CD8+T细胞占总CD8+T细胞的比例升高（P=0.025）。此外,我们还在差异表达基因中发现MAGE-C3上调VIM的mRNA水平,探索后发现高表达MAGE-C3能提高STAT3的705位点磷酸化水平,同时上调 EMT（Epithelial-MesenchymalTransition）相关分子 Vimentin 的蛋白水平、下调E-cadherin的蛋白水平,提示我们MAGE-C3可能通过EMT方式促进细胞侵袭及迁移。综上,我们从食管鳞癌病人全基因组测序中挑选了具有突变以及拷贝数扩增的肿瘤抗原MAGE-C3进行深入研究,发现其不仅从内部促进细胞EMT过程提高细胞的侵袭能力,还对外部肿瘤微环境发挥免疫抑制功能,最终共同促进了肿瘤的进展。

论文目录

文章来源

类型: 博士论文

作者: 吴清楠

导师: 詹启敏

关键词: 细胞周期,循环,食管鳞癌,拷贝数扩增,免疫抑制,转移

来源: 北京协和医学院

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,肿瘤学

单位: 北京协和医学院

基金: 国家自然科学基金(No.81490753),国家重点基础研究发展(973)计划(2015CB553904)

分类号: R735.1;Q25

DOI: 10.27648/d.cnki.gzxhu.2019.000270

总页数: 170

文件大小: 14226K

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