一、不同温度两类诱导剂形成细菌L型的研究（论文文献综述）
陈云[1]（2021）在《糖基转移酶GL24971的异源表达及其过表达对灵芝多糖合成的影响》文中进行了进一步梳理真菌多糖大多从食、药用真菌中提取而来,已广泛应用于传统饮食和药物,其中灵芝多糖（Ganoderma lucidum polysaccharide,GLP）是应用范围较广的代表之一,具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节和肠道菌群调节的作用。灵芝多糖的合成途径较复杂,以核苷酸糖为供体的多糖的合成机制尚不清晰,因此,本研究基于前期对灵芝的全基因组序列注释和转录组水平分析,选取与多糖合成相关的葡萄糖基转移酶GL24971进行研究,初步探究葡萄糖基转移酶GL24971对灵芝发酵的影响,主要研究内容和结果如下:（1）从灵芝中获取葡萄糖基转移酶GL24971的编码基因片段,对该酶的氨基酸序列进行比对分析,发现它与其他来源的大型真菌中糖基转移酶3家族（GT3）的氨基酸序列高度相似,能催化葡聚糖链的延伸;在此基础上构建大肠杆菌重组菌株E.coliBL21（DE3）/pET28a-GL24971,实现了酶的异源表达。通过优化诱导温度、诱导剂添加浓度和表达载体,增加了目的蛋白的可溶性表达量;（2）构建灵芝过表达的重组质粒exp-GL24971-eGFP,该质粒以灵芝来源的gpdi为启动子,带有潮霉素抗性筛选标记,并将荧光蛋白eGFP与目的基因融合,作为标记基因。使用聚乙二醇（PEG）转化法将过表达质粒转化至灵芝原生质体,通过激光共聚焦显微镜观察检测到eGFP荧光信号,同时qRT-PCR检测结果表明过表达的转化菌株中目的基因的转录水平提高,选择过表达水平最高的两株灵芝转化菌株T1和T2,进一步对其展开灵芝多糖合成过程的相关研究;（3）对过表达的转化菌株进行液体发酵,探究过表达葡萄糖基转移酶GL24971对灵芝菌株多糖合成与生长情况的影响。结果表明,葡萄糖基转移酶GL24971的过表达提高了单位菌体胞外多糖的产量,最大产量为0.07 mg·mg-1,相对于原始菌株提高了132.4%,同时胞内多糖的产量降低了10.7%;葡萄糖基转移酶GL24971的过表达使得转化菌株胞外多糖组分中葡萄糖的比例增加,半乳糖的比例减少;发酵过程中,菌体形态及生长也发生改变,原始菌株菌体形态不规则,表面较粗糙,而转化菌株的菌体形态基本为球形,表面较光滑;微观形态探究结果显示,细胞壁中的几丁质和β-1,3-葡聚糖含量整体水平下降,结束发酵时,几丁质和β-1,3-葡聚糖含量分别降低了16.7%、29.3%;生物透射电镜（TEM）观察的结果表明,发酵过程中,转化菌株细胞壁的平均厚度都降低。
张庆冬[2]（2021）在《外切型肝素酶的发现、催化机制研究以及应用》文中认为肝素（Heparin,HP）/硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate,HS）是由重复二糖单元组成的一类线性的聚阴离子酸性多糖,是一类重要的糖胺聚糖（Glycosaminoglycan,GAG）。HP/HS广泛地分布于细胞表面或细胞间基质中,甚至在某些细胞内环境中也有发现。自1935年起,HP由于其良好的抗凝血活性被广泛地应用于临床治疗中。由于HP/HS在生物合成过程中,其多糖骨架在众多修饰酶的作用下,形成了异常复杂的结构,使得HP/HS能与多种活性蛋白分子相互作用进而参与影响一些生理及病理过程。尽管高度复杂的结构赋予了HP/HS多种多样的生物学活性,但同时也阻碍了研究学者们对HP/HS构效关系的研究。细菌来源的肝素酶（Heparinase,Hepase）是一类专一性降解HP/HS底物的多糖裂解酶。Hepases在HP/HS的构效关系研究、HP/HS寡糖及低分子肝素（Low-molecular-weight-heparin,LMWH）的制备过程中具有着重要的应用。已鉴定的肝素酶分为三类:Hepase Ⅰ、Hepase Ⅱ和Hepase Ⅲ,均为内切型裂解酶。然而,对HP/HS结构研究非常重要的外切型肝素酶（exoHepase）却一直未见报道。我们从 NCBI（The National Center for Biotechnology Information）数据库中筛选到了 5个来自PL152亚家族的exoHepase基因,并对它们进行了克隆表达纯化和深入的酶学性质、底物特异性研究、结构研究以及初步应用。主要成果包括以下几个方面:（1）PL152亚家族肝素酶的筛选及活性鉴定:我们从NCBI数据库中筛选了 5个指认为Hepase的候选基因,分别命名为BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep和BFexoHep。通过对它们进行生物信息学分析,我们发现BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep 和 BFexoHep 归类于 PL152 亚家族,并且它们基本由N端的信号肽,DUF4962结构域以及C端Hepase-Ⅱ-Ⅲ家族结构域组成。并且,它们与已鉴定的肝素酶Hepase Ⅰ,Hepase Ⅱ和Hepase Ⅲ相似度极低,反而与来源于PL151亚家族的外切型褐藻胶裂解酶Atu3025相似度最高。在对BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep 和 BFexoHep 进行异源表达纯化并验证活性之后发现,它们仅降解HP/HS底物,并不降解褐藻胶底物,其中它们对HP底物的活性远高于对HS底物的活性。因此我们得出结论,PL15家族的两个亚家族的酶类具有不同的底物选择性:PL151亚家族中的裂解酶专一性地降解褐藻胶底物;PL152亚家族中的裂解酶专一性地降解HP/HS底物。（2）PL152亚家族肝素酶的酶学性质研究:由于BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep和BFexoHep对HP/HS底物的酶活较低,因此我们首先制备了一批硫酸化度较高的底物HP-FαⅢ（Hepase Ⅲ降解HP的终产物）来对PL152亚家族肝素酶的酶学性质进行研究。实验结果证明:PL152家族的肝素酶大多适应于中性pH以及低温环境,如20℃。当环境温度高于30℃时,它们的酶活急剧下降,表明它们对温度比较敏感。研究显示,Co2+、Hg2+、Ni2+、Pb2+、Cu2+和Zn2+等重金属离子均能对PL152家族的肝素酶的酶活产生强烈的抑制作用。二价金属离子如Ca2+、Ba2+和Mg2+等能对这些肝素酶的活性产生明显的促进作用,与之相应的,二价金属离子螯合剂EDTA和EGTA均能对这些肝素酶的活性呈现出不同程度的抑制作用,表明二价金属离子在PL152亚家族的肝素酶的活性中发挥着非常重要的作用。此外,适当浓度的盐（NaCl或KCl）能够显着地促进上述PL152亚家族肝素酶酶活,表明盐参与了该类肝素酶的催化过程。经研究,BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep 和 BFexoHep 对 HP-FαⅢ的酶活分别为 49.89、61.86、26.75、24.25 和 12.15 U/mg。BIexoHep 和 BCexoHep对 HP 的比酶活分别为 0.75 和 1.14 U/mg。BTexoHep、PAexoHep 和 BFexoHep对 HP 的比酶活极低,小于 0.5 U/mg。此外,BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep和BFexoHep对HS的比酶活均远小于0.5 U/mg。以上结果表明,PL152亚家族的肝素酶倾向于降解硫酸化度较高的底物。（3）PL152亚家族肝素酶的降解模式及降解方向研究:我们分别用PL152亚家族的肝素酶 BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep 和 BFexoHep 对HP多糖进行时间梯度降解,发现在降解过程中仅生成不饱和HP二糖产物,在该过程中没有明显的大分子量不饱和寡糖被检测到;之后我们又用它们对饱和的HP十三糖（DP13）进行时间梯度降解,同样的,在降解过程中仅生成不饱和HP二糖产物。这说明它们都是之前一直未见报道的外切型肝素酶（exoHepase）。进一步地研究表明,本论文中的PL152亚家族的exoHepases不能降解还原端荧光标记的HP DP13,意味着HP糖链还原端标记引入的荧光基团阻碍了 PL152亚家族exoHepases对底物的降解,从而证明该类酶对底物的降解是从还原端开始的,并以二糖为单位向非还原端逐次切割底物。这是Hepases研究领域首次发现的外切型肝素酶,不但填补了该领域的空白状态,更为HP/HS的构效关系研究提供了亟需的工具酶。（4）exoHepases的底物结构选择性研究:为了探究这类PL152亚家族exoHepases的底物特异性,我们首先制备了一些结构确定的HP四糖,分别为:P4-4（AUAl-4GlcNAc6S 1-4GlcA1-4GlcNS6S 和ΔUA1-4GlcNAc6S 1-4IdoA1-4GlcNS6S）、P4-5（AUA1-4GlcNS 1-4GlcA 1-4GlcNS6S和 ΔUA1-4GlcNS1-4IdoA1-4GlcNS6S）、P4-6（ΔUA 1-4GlcNS6S 1-4GlcAl-4GlcNS6S）、P4-7（AUA2S1-4GlcNS6S 1-4GlcA 1-4GlcNS6S）和 P4-8（ΔUA2S1-4GlcNS6S1-4IdoA2S1-4GlcNS6S）。研究发现,HP 四糖 P4-4、P4-5、P4-6、P4-7和P4-8均能被过量的exoHepases彻底降解,说明exoHepases对底物中的糖醛酸构型没有选择性。然而,我们发现exoHepases对糖醛酸构型存在不同的倾向性:exoHepases倾向于降解含IdoA2S的底物,其次为含GlcA的底物,相比之下,对含IdoA的底物的偏好性最差。此外,exoHepases倾向于降解硫酸化度较高的底物,底物的硫酸化度越高,如P4-8（六硫酸化HP四糖）,则exoHepases酶活就越高;底物的硫酸化度越低,如P4-4（三硫酸化HP四糖）,则exoHepases酶活就越低。该种现象解释了为什么exoHepases对高硫酸化度的HP底物降解活性好,却对低硫酸化度的HS底物降解活性好差。尽管exoHepases对高硫酸化度的底物降解活性较强,然而当底物中有3-O硫酸化修饰时,如磺达肝癸钠,便对exoHepases的活性产生了抗性,不能被降解完全。（5）exoHepases的结构及催化模式研究:通过对所鉴定的exoHepases中一个代表性酶BIexoHep进行结构研究,我们发现BIexoHep的结构主要由三个结构域组成:N末端小的β-折叠结构域,中心（α/α）5不完整桶状结构域和C端β-三明治结构域。BIexoHep的晶体结构呈现为单体而不是二聚体形式,并且每个BIexoHep蛋白分子中都含有两个Ca2+。BIexoHep难以单独成晶,需要与HP二糖产物共结合方能产生稳定的蛋白晶体。BIexoHep的结构与已鉴定的肝素酶Hepase Ⅰ、Hepase Ⅱ以及Hepase Ⅲ的结构之间相似度很低,但是通过将BIexoHep与Hepase II叠加分析发现,两者的的活性中心组成尤为相似,意味着两者的催化机制可能存在一定的相似性。关键氨基酸突变研究揭示了 BIexoHep的潜在底物催化机制:（1）降解含IdoA的底物时,His337作为Bronsted碱夺取IdoA中C5的质子,而Tyr390充当Bronsted酸向1-4糖苷键中的氧提供质子,从而完成β消除反应;（2）当降解含GlcA的底物时,Tyr390将同时充当Bronsted碱和酸完成β消除反应。进一步,通过制备和解析BIexoHep与HP四糖底物的共晶结构,我们发现在BIexoHep的结构中,有一个半开放的、狭长的呈“L”形的催化腔。BIexoHep特殊的半开放“L”形反应通道由两个几乎相互垂直的部分组成:带正电荷的进口部分与带负电荷的出口部分。正是该特殊反应通道的存在,赋予了 BIexoHep外切酶活性。结合关键氨基酸突变实验,我们提出exoHepases的底物外切催化机制假设:（1）首先,环境中带负电荷的游离HP糖链在电荷吸引的作用下,其还原端与“L”反应通道带正电的入口部分结合;（2）在电性吸引的作用力下,HP糖链深入“L”反应通道带正电的入口部分,一旦还原端二糖到达“+1”和“+2”位点,还原端二糖将通过β-消除机制被降解下来;（3）被降解下来的HP不饱和二糖在带负电荷的氨基酸残基Asp335的电性排斥作用下,迅速地被推入带负电荷的出口部分,然后在氨基酸残基Pro67和Asp281电性排斥作用下迅速从出口释放。（6）exoHepase的初步应用:我们利用exoHepases从HP/HS底物还原端以二糖为单位进行酶解的特性开发出了一种新型的HP/HS酶学测序方法。该测序方法通过用BIexoHep对HP不饱和寡糖进行不完全降解,进而制备相应的非还原端UDP4、UDP6、UDP8...UDP2n。然后,通过分析比较这些不饱和寡糖的二糖组成,进而推测出完整的HP寡糖序列。在本论文中,我们运用该方法,成功地对 5 种HP 八糖进行了初步测序,分别为:P8-1ΔUA1-4GlcNS6S 1-4HexA2S 1-4GlcNS6S-4HexA2S 1-4GlcNS6S 1-4HexA2S 1-4Glc NS、P8-2ΔUA 1-4GlcNS6S 1-4HexA2S 1-4GlcNS-4HexA2S 1-4GlcNS6S 1-4HexA2S 1-4GlcNS 6S、P8-3ΔUA1-4GlcNAc（S）1-4HexA2S1-4GlcNS6S-4HexA2S1-4GlcNS6S1-4HexA1-4GlcN S6S、P8-4ΔUA1-4GlcNS6S1-4HexUA2S 1-4GlcNS6S 1-4HexUA2S1-4GlcNS6S1-4HexUA2S1-4GlcNS6S 和P8-5△UA1-4GlcNAc（S）1-4HexA2S 1-4GlcNS6S1-4HexA2S1-4GlcNS6S1-4HexA2S1-4G lcNS6S。该方法操作简易,以二糖为单位对HP寡糖进行序列鉴定,大大地简化了实验步骤;利用荧光标记,极大的降低了样品的用量和提高了分析检测的灵敏度;理论上该方法不仅能对复杂HP八糖进行测序,还可以对更大分子量的HP/HS寡糖进行序列分析。本论文对来自PL152亚家族的5个exoHepases进行了详细的酶学性质研究、底物特异性研究、三维结构与催化机制研究和初步应用。本论文对exoHepases的研究不仅填补了 Hepases领域的空白,更是为HP/HS结构研究提供了潜在的工具酶。
唐恬[3]（2021）在《基于代谢组学的金黄色葡萄球菌不稳定型L-型形成机制研究》文中进行了进一步梳理细菌L-型是指细菌细胞壁缺陷型,在体内外以及人工诱导情况下均可形成,对作用于细胞壁的抗菌药物耐受。金黄色葡萄球菌可形成L-型,与慢性、反复感染密切相关。目前,关于金黄色葡萄球菌L-型的形成机制尚未明确。本项目从代谢水平探讨了金黄色葡萄球菌细菌L-型的形成机制。目的:1.基于金黄色葡萄球菌Newman株L-型的代谢组学检测结果,探讨L-型形成过程中的代谢变化。2.探究glt B对金黄色葡萄球菌细菌L-型、持留菌和生物被膜形成及细菌毒力的影响。方法:1.制备L-型诱导培养基（LIM）,接种金黄色葡萄球菌Newman株稳定期培养液,诱导建立其不稳定型L-型模型。2.采用PBS冲洗收集在LIM上诱导培养至72h的金黄色葡萄球菌L-型及对照培养基上培养的普通型（N-型）标本,通过非靶向代谢组学测定后,对差异代谢产物进行生物信息学分析。探讨金黄色葡萄球菌L-型的代谢特点,筛选与其形成可能相关的通路。3.将培养至稳定期的金黄色葡萄球菌野生株及glt B基因敲除株（Δglt B）菌液接种LIM并进行诱导培养,观察野生株和Δglt B的L-型形成能力。4.PCR扩增金黄色葡萄球菌Newman株glt B,经过双酶切后与质粒pRAB11连接转化大肠埃希菌DC10B,获得pRAB11-glt B重组质粒,并将pRAB11和pRAB11-glt B分别电转金黄色葡萄球菌野生株和Δglt B,获得WT::pRAB11、Δglt B::pRAB11和回补株Δglt B::pRABglt B。使用含100ng/m L脱水四环素的TSB诱导培养后收集总RNA,选用q-PCR测定3株菌的glt B表达水平。将3株菌株接种含脱水四环素的TSA平板,培养24h后观察各菌株的生长特性及色素产生能力。5.将WT::pRAB11、Δglt B::pRAB11和回补株稳定期菌液分别接种含有脱水四环素的LIM,并进行诱导培养,动态观察3株菌株L-型的形成能力和生长速度。6.采用抗生素暴露试验测定WT::pRAB11、Δglt B::pRAB11和回补株在含脱水四环素的TSB中培养至3h、4h、5h、6h、9h及24h时对氨苄青霉素（20μg/m L）和诺氟沙星（20μg/m L）的敏感性,判断glt B敲除和回补对金黄色葡萄球菌持留菌形成能力的影响。7.采用96孔板将菌株WT::pRAB11、Δglt B::pRAB11及回补株在含脱水四环素的TSB中培养24h。采用结晶紫染色和OD570nm测定判断glt B敲除和回补对金黄色葡萄球菌生物被膜形成能力的影响。8.选用BALB/C雌性小鼠,采用腹腔注射法测定金黄色葡萄球菌野生株和突变株Δglt B对小鼠的半数致死量(LD50),判断glt B敲除对细菌毒力的影响。采用q-PCR检测野生株和突变株主要毒力基因hla、hlg A、hlg B、hlg C、luk D、luk E、luk F、luk S、NWMN＿1503、NWMN＿1873、NWMN＿1926、NWMN＿2071、eta、sea的表达状况。结果:1.金黄色葡萄球菌Newman株在LIM上诱导72h后形成了不稳定型L-型,在倒置显微镜下观察,菌落呈典型“油煎蛋”样。2.非靶向代谢组学检测结果显示,诱导培养72h的金黄色葡萄球菌L-型与N-型对照标本比较,共有138种差异性代谢物,其中62种升高,76种下降,表明金黄色葡萄球菌L-型的整体代谢稍活跃。差异性代谢物主要富集于ABC转运系统、氨基酸合成和代谢、核苷酸代谢、双组分系统、碳代谢、氮代谢、氧化磷酸化、谷胱甘肽代谢等通路。3.与金黄色葡萄球菌野生株相比,Δglt B形成L-型的能力明显下降,在诱导培养72h时形成的菌落小、数量少且形态不典型,个别呈“油煎蛋”样,菌落生长速度明显滞后于野生株。4.本研究成功构建了金黄色葡萄球菌WT::pRAB11、Δglt B::pRAB11和回补株Δglt B::pRABglt B菌株。经脱水四环素诱导后,回补株中glt B基因呈显着高表达。3株菌株在含有脱水四环素的TSA上均可形成S型菌落,但是WT::pRAB11的金黄色色素产生能力显着强于Δglt B::pRAB11和回补株。5.WT::pRAB11和回补株均能在LIM上诱导72h后形成典型的“油煎蛋”样菌落,回补株的菌落数目略少于WT::pRAB11株。Δglt B::pRAB11形成了少量“油煎蛋”样菌落,且其菌落体积小,并可见少量“颗粒型”菌落,表明Δglt B::pRAB11的L-型形成能力显着低于WT::pRAB11和回补株。6.在含脱水四环素的TSB中培养至第3h、4h、5h、6h时,WT::pRAB11、Δglt B::pRAB11及回补株对抗生素氨苄青霉素和诺氟沙星的敏感性未见显着性差异,所有细菌在药物暴露2d后均被杀死。但是Δglt B::pRAB11的9h培养物在氨苄青霉素和诺氟沙星中分别暴露5d和9d均被杀死,而WT::pRAB11分别需要7d和10d才可被全部杀死。Δglt B::pRAB11的24h培养物在氨苄青霉素和诺氟沙星中分别暴露11d和7d均被杀死,而WT::pRAB11的24h培养物在药物作用12d后均仍有大量活菌存在。表明glt B::pRAB11的持留形成能力显着低于WT::pRAB11,回补株回复了对氨苄青霉素和诺氟沙星的持留形成能力。7.在含脱水四环素的TSB中培养24h后观察,WT::pRAB11和回补株的生物被膜形成能力明显强于Δglt B::pRAB11;WT::pRAB11和回补株的OD570nm分别为3.784±0.0173和3.700±0.0164,显着高于Δglt B::pRAB11的2.460±0.1055（P<0.05）。表明Δglt B::pRAB11相较于WT::pRAB11的生物被膜形成能力显着下降。回补株回复了生物被膜的形成能力。8.金黄色葡萄球菌野生株对小鼠的LD50为2.6×109CFU/m L,突变株的LD50为1.065×1010CFU/m L,约为野生株的4.1倍,表明突变株的毒力显着下降。q-PCR测定野生株和突变株的毒力基因表达结果显示,除hlg B外,突变株其余13个毒力基因均呈显着性下调（P<0.05）。结论:1.金黄色葡萄球菌L-型与同期的N-型比较,代谢产物和代谢通路发生了显着改变,代谢水平调整在金黄色葡萄球菌L-型形成及生长过程中发挥重要作用。其中氨基酸代谢和合成（主要包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸合成、谷氨酰胺-谷氨酸代谢等）、碳代谢、ABC转运系统、氮代谢等代谢通路与金黄色葡萄球菌L-型的形成密切相关。2.金黄色葡萄球菌谷氨酸合成酶大亚基基因glt B在其L-型、持留菌、生物被膜形成过程中发挥重要作用,且通过对其主要毒力因子产生的影响调控细菌的毒力。
李伟[4]（2020）在《2株海洋来源链霉菌次级代谢产物多样性研究》文中进行了进一步梳理本论文通过改变培养方式、添加化学诱导剂（elicitor）、分析次级代谢产物合成基因簇,研究2株海洋来源链霉菌次级代谢产物的多样性。菌株经16S r DNA鉴定为灰略红链霉菌Streptomyces sp.FJNU027（FJNU027）和浅紫链霉菌Streptomyces sp.FJNU028（FJNU028）。海洋来源链霉菌FJNU027通过添加化学诱导剂,激活沉默基因簇,以增加其次级代谢产物多样性。在海洋来源链霉菌FJNU027培养过程中加入化学诱导剂,发现发酵液颜色发生变化,利用薄层层析（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、液相色谱质谱联用（LC-MS）分析,发现在化学诱导剂suberoylanilide hydroxamic acid（SAHA）的作用下,增加了其次级代谢产物的多样性。利用antiSMASH分析海洋来源链霉菌FJNU027次级代谢产物合成基因簇,发现总共有25个潜在次级代谢产物合成基因簇,可能合成的产物包括5个萜类、3个PKS、2个四氢嘧啶类、2个NRPS、2个铁载体、1个羊毛硫肽类、1个吩嗪类、2个细菌素和1个丁内酯类及6个其他产物,且大部分都是未知次级代谢产物合成基因簇,或是具有极低相似性的已知次级代谢产物合成基因簇,因此海洋来源链霉菌FJNU027具有产生新颖次级代谢产物的潜力。对海洋来源链霉菌FJNU027中分离得到的5个新次级代谢产物与基因簇进行比对,大致确定了新次级代谢产物与基因簇的对应关系。海洋来源链霉菌FJNU028通过改变培养条件,激活沉默基因簇,以增加其次级代谢产物多样性。从28种培养基中筛选出一种发酵周期短,次级代谢产物丰富,具有良好抑制酿酒酵母活性的培养基:20%YPD培养基。以抑制酿酒酵母活性为指标,确定最佳发酵周期为4天。以抑制酿酒酵母活性为指标,确定500 m L三角瓶最佳装液量为450 m L。利用最佳培养方式发酵海洋来源链霉菌FJNU028 150 L,从中获得9.3 g具有良好抑制酿酒酵母活性的有机粗提物。海洋来源链霉菌FJNU028通过添加化学诱导剂,激活沉默基因簇,期望增加其次级代谢产物多样性。通过TLC、HPLC分析海洋来源链霉菌FJNU028次级代谢产物多样性变化,发现该菌株对化学诱导剂不敏感,未能出现新次级代谢产物。利用antiSMASH分析海洋来源链霉菌FJNU028次级代谢产物合成基因簇,发现总共有24个潜在次级代谢产物合成基因簇,可能合成的产物包括5个萜类、4个PKS、5个NRPS、3个细菌素、2个铁载体、1个类NRPS、1个羊毛硫肽类和1个四氢嘧啶类及2个其他产物,且大部分都是未知次级代谢产物合成基因簇,或是具有极低相似性的已知次级代谢产物合成基因簇,因此,海洋来源链霉菌FJNU028具有较大合成新次级代谢产物的潜力。本论文通过改变发酵方式和添加化学诱导剂来激活沉默基因簇,增加了海洋来源链霉菌FJNU027和FJNU028次级代谢产物的多样性。通过antiSMASH分析了海洋来源链霉菌FJNU027和FJNU028次级代谢产物合成基因簇,并对海洋来源链霉菌FJNU027中分离得到的5个新次级代谢产物与基因簇进行比对,大致确定了新次级代谢产物与基因簇的对应关系。本论文研究表明,改变发酵条件和添加化学诱导剂是增加目的菌次级代谢产物多样性的有效方法;本研究为海洋来源放线菌菌种资源的充分利用提供了参考依据。
王群[5]（2020）在《基于CRISPR/Cas蛋白的副溶血弧菌检测方法的研究》文中提出副溶血弧菌是一种嗜盐、革兰阴性菌,广泛分布在水体、水底沉积物、水生生物体内,在全球频繁地引起食物中毒,多发生在夏季的沿海地区,是全球食源性疾病的重要病原体。近年来由于副溶血弧菌引起的食物中毒发生率逐年增长。副溶血弧菌的主要致病因子是耐热溶血素（TDH）、耐热相关溶血素（TRH）。副溶血弧菌感染主要可以引起胃肠炎及伤口感染,罕见情况下可以导致败血症,副溶血弧菌导致的胃肠炎是重要的公共卫生事件,而副溶血弧菌的快速检测则是处置这些公共卫生事件的前提。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是存在于古生菌和细菌中的一种获得性免疫系统,在细菌和古生菌防止外来病原体入侵中发挥重要作用。CRISPR免疫功能中所涉及的对特异性核酸片段进行识别并且酶切的功能在病原体检测中发挥了作用。CRISPR 检测体系发挥作用需要 Cas（crispr associate protein）,gRNA（guide RNA）和靶标序列（target）。本研究的目的是建立基于CRISPR/Cas的副溶血弧菌快速检测方法,包括Cas蛋白的提取和纯化,gRNA的设计和提取以及荧光显色系统的设计和检测。本研究选择使用Cas12a蛋白,首先通过在NCBI搜索获得Cas12a蛋白的表达序列,将其合成并构建到表达载体上,转入感受态细胞中在适宜条件下表达,然后提取纯化。第二部分是对gRNA的设计获得,通过已有的副溶血弧菌的特异性基因tdh、trh以及弧菌特异性基因toxR的比对分析,挑选出其中最保守的、最特异且长度在20-30 bp左右的序列,结合Cas12a需要特异性识别PAM（prospaceradjacent motif）,即5’-TTTA-3’,将序列构建到载体上进行体外转录后提取gRNA。最后一部分是将显色基团FAM和淬灭基团BHQ Ⅰ连接在单链DNA的两端,当有副溶血弧菌存在时,CRISPR-VP系统在剪切靶标序列的同时也会将荧光显色系统的单链DNA切断,释放出荧光信号,使其对副溶血弧菌的检测具有更直观的结果。实验中将各组分按照比例配好CRISPR-VP反应体系,利用罗氏荧光PCR仪在37℃恒温条件下进行荧光信号的检测,通过荧光值以及荧光曲线实现对副溶血弧菌的鉴定。本研究初步建立的CRISPR-VP检测方法是基于CRISPR系统特异性剪切原理,使得该方法具有高特异性和灵敏性,同时荧光显色系统的应用使得在结果的判定上更加直观,克服传统检测中人为误差的存在,使检测结果更加准确。
高歌[6]（2020）在《谷氨酸棒杆菌利用木糖合成L-鸟氨酸的代谢工程改造研究》文中进行了进一步梳理L-鸟氨酸是一种碱性氨基酸,其对人体具有保肝、护肝、治疗肝脏疾病、抗癌和刺激人体生长激素分泌等作用。通常依靠微生物发酵的方式来进行L-鸟氨酸的产业链合成。其中,谷氨酸棒杆菌是被普遍用于生产各种氨基酸及其衍生物的发酵育种的优势菌种,同时也是用于合成L-鸟氨酸的主流菌种。然而利用微生物发酵法合成L-鸟氨酸需要消耗大量的底物葡萄糖,提取压力增加,并且在耕地面积不断减少,这个问题所造成的负面影响与日俱增。因此,探寻葡萄糖的可替代碳源成为眼下研究的热点。木质纤维素是来源广泛的可重复产生的自然资源之一,利用酸解或酶解的方法可将其转化为还原性糖,其中木糖与葡萄糖在所有还原糖中占据的比例最大。本文在已有重组谷氨酸棒杆菌SO26的基础上,借助代谢工程策略构建能同时利用葡萄糖和木糖进行发酵合成L-鸟氨酸的菌株。主要研究内容包括:（1）将来自于野油菜单胞菌的木糖异构酶及木酮糖激酶的xylAB编码基因克隆至穿梭表达载体pXMJ19中,导入重组谷氨酸棒杆菌SO26内,对IPTG的最佳添加时间与浓度进行优化。研究结果显示初始添加IPTG终浓度为0.5 mM时较其它条件所添加的浓度获得了最大的L-鸟氨酸产量,木糖消耗了 47.9%,L-鸟氨酸产量可达21.6 ±0.19 g/L。（2）探究在谷氨酸棒杆菌中,编码戊糖转运子araE基因的敲入、编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶pepc基因的过表达以及定点突变改造对合成L-鸟氨酸的影响。通过使用基因工程工具改造修饰后可使L-鸟氨酸合成量达到27.1 ± 0.32 g/L。（3）探究添加生物素以及盐酸硫胺素作为各类辅酶是否可以提高L-鸟氨酸的合成量。发酵结果显示在添加0.2 mg/L生物素和5 mg/L盐酸硫胺素时,促进了谷氨酸棒杆菌生长速率,IL-鸟氨酸产量提高到了 33.4 ± 0.49 g/L。之后优化了发酵液成分与条件,其中主要对最适pH进行探究,结果表明在发酵液初始pH为6.7时,获得了 37.5± 0.63 g/L的L-鸟氨酸。通过葡萄糖与木糖浓度比为2:1的混合培养重组菌种,在实验室阶段模拟利用木质纤维素。结果显示出混糖比葡萄糖与木糖单独培养时具有显着的优势,进一步可使L-鸟氨酸产量达41.5±0.02 g/L,较起始菌种提升了 7%,平均产率为 0.576 g/（L·h）。
丁娇[7]（2020）在《铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）CHAOHU-1326纤维素合成的研究》文中研究表明蓝细菌水华是富营养化湖泊中非常常见的生态灾害,对其进行防治的基础是揭示水华发生的机理。在我国报道的蓝细菌水华中,铜绿微囊藻是最主要的蓝细菌之一。铜绿微囊藻表面的胞外多糖中含有大量的纤维素,纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖,由独特的丝状纤维组成,这种纤维素具有多孔网状结构,是一种纳米级的生物高分子聚合物,具有很高的工程应用价值。蓝细菌纤维素的生物合成与很多细菌有非常相似的发生机制,本研究基于其分子生物学合成机制推测其合成可能受环二鸟苷酸的调控。本文以铜绿微囊藻藻株CHAOHU-1326（Microcystis aeruginosaaa CHAOHU-1326）为实验的研究对象,探究了 8种不同的L型氨基酸对铜绿微囊藻的生长以及胞外多糖合成产生的影响;对藻株M.aeruginosa CHAOHU-1326纤维素合成酶基因编码的蛋白进行了生物信息学分析;构建了纤维素合成酶的异源表达和过表达系统,以探究环二鸟苷酸（c-di-GMP）对多糖合成的作用。本文的主要研究内容和研究结果如下:（1）L-精氨酸和L-赖氨酸对铜绿微囊藻CHAOHU-1326的生长有促进作用,而对胞外多糖的合成有抑制作用;L-蛋氨酸和L-异亮氨酸对铜绿微囊藻CHAOHU-1326的生长量几乎没有影响,但对其胞外多糖的合成有促进作用:L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-组氨酸和L-甘氨酸对铜绿微囊藻的生长有抑制作用,对胞外多糖的合成有促进作用。上述结果表明,L型氨基酸有可能作为第一信使分子对铜绿微囊藻产生不同的生理影响,包括纤维素多糖的合成。（2）基因celA编码的蛋白CelA的氨基酸数目为741,分子量84.84 KD,等电点8.71,为不稳定疏水性蛋白,存在9个螺旋跨膜区。BcsA的氨基酸数目为475,分子量53.51 KD,等电点5.65,是稳定的疏水性蛋白,存在4个螺旋跨膜区。CelA和BcsA均为定位到细胞膜上的纤维素合成酶,无信号肽,蛋白质二级结构主要由α螺旋、无规卷曲和延伸链构成。其中CelA蛋白为具有PilZ结构域的纤维素合成酶,可能受c-di-GMP的调控,催化的底物是UDP-葡萄糖。而BcsA可能具有催化多糖链延伸的作用。从上述分析可以得出,铜绿微囊藻CHAOHU-1326的纤维素合成可能受环二鸟苷酸的调控,当藻细胞接受到外界环境第一信使的信号刺激后,由第二信使放大信号,然后调控纤维素合成酶的活性,催化葡萄糖合成纤维素。（3）成功构建了纤维素合成酶基因celA的蛋白表达系统,成功构建了 celA和bcsA的过量表达系统。成功将重组质粒pET-32a（+）-celA分别转化入表达宿主大肠杆菌 E.coli BL21（DE3）、E.coli RosettagamiTM2（DE3）plysS、E.coli C43（DE3）pLysS进行异源表达。通过三亲本杂交构建纤维素合成酶过表达体系,构建了重组质粒 pRL1342-celA和 pRL1342-bcsA。综上所述,本文针对铜绿微囊藻纤维素合成的研究,可为蓝细菌资源化应用提供一定理论依据,为蓝细菌纤维素的开发应用奠定基础;另外可加深对蓝细菌水华的科学认识,从而为蓝细菌水华的防治提供理论支持。
张健宁[8]（2020）在《菲律宾蛤仔凝集素VpClec-1和VpClec-2基因克隆、组织表达与免疫活性的初步研究》文中提出我国贝类养殖产业迅速发展的同时,出现了一系列病原体入侵引起的健康问题,严重制约着海洋生态的可持续发展。挖掘贝类响应病原菌胁迫的关键因子,可为贝类的免疫防御机制研究提供可靠的数据支撑,同时对养殖过程中的疾病控制和健康管理具有十分重要的理论意义。本论文在菲律宾蛤仔中克隆出两种免疫相关分子——C型凝集素（VpClec-1、VpClec-2）,对其序列进行分析;利用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）,对两种C型凝集素在菲律宾蛤仔中的组织分布特性进行研究;构建相应的重组蛋白,并对其免疫活性进行具体探究,得到研究结果如下:（1）基因序列分析结果显示,菲律宾蛤仔VpClec-1基因cDNA序列的全长为588 bp,开放阅读框（ORF）为489 bp,编码162个氨基酸,等电点为pI=4.26,蛋白预测分子量为15.98 kDa;VpClec-2基因cDNA序列的全长为688 bp,ORF为555 bp,编码184个氨基酸,等电点为p I=8.40,蛋白预测分子量为18.74 kDa。对VpClec-1和VpClec-2基因的氨基酸序列进行同源性分析、多序列比对,发现两种基因均与C型凝集素序列和结构特点相似,是C型凝集素家族的新成员。（2）qRT-PCR结果显示,VpClec-1和VpClec-2基因在菲律宾蛤仔血淋巴细胞、肝胰腺、鳃、外套膜、肌肉中均有表达。在鳗弧菌刺激菲律宾蛤仔后,VpClec-1和VpClec-2基因的mRNA表达量均表现为上调,其中VpClec-1基因表达量在鳗弧菌刺激后明显上调,24 h达到峰值;而VpClec-2在刺激后6 h（8.25倍,p<0.01）、12 h（16.7倍,p<0.01）和24 h（24.2倍,p<0.01）出现急性上调,二者均在48 h接近于正常水平。表明VpClec-1和VpClec-2基因参与了菲律宾蛤仔抵抗病原微生物入侵的免疫应答过程。（3）构建的重组蛋白rVpClec-1和rVpClec-2都能识别和结合脂多糖、葡聚糖和酵母多糖等配体,且结合能力呈剂量依赖性;rVpClec-1和rVpClec-2均显示出对哈维氏弧菌、灿烂弧菌、鳗弧菌、阴沟肠杆菌和嗜水气单胞菌的强凝集活性,而对金黄色葡萄球菌没有明显的凝集活性。与rVpClec-2相比,重组蛋白rVpClec-1显示出对鳗弧菌、阴沟肠杆菌和嗜水气单胞菌更强的抑菌/凝集活性,但对金黄色葡萄球菌和灿烂弧菌则没有;此外rVpClec-1和rVpClec-2均能显着提高血淋巴细胞的吞噬作用,尤其是rVpClec-2具有明显的诱导血淋巴细胞吞噬活性的能力,而rVpClec-1可促进血淋巴细胞的趋化能力,r VpClec-2则对其趋化能力没有明显作用;同时rVpClec-1和rVpClec-2也可促进血淋巴细胞的包囊化能力,这表明在菲律宾蛤仔固有免疫反应中二者都具有一定的免疫调节作用。综上,菲律宾蛤仔凝集素VpClec-1和VpClec-2作为模式识别受体,在菲律宾蛤仔免疫防御过程中发挥不可或缺的作用,研究结果为深入了解贝类固有免疫防御机制提供了一定的理论支持。
张文盼[9]（2020）在《超交联多孔聚合物的制备及手性识别性能研究》文中研究说明目前已知的手性氨基酸药物存在D型和L型两种,大多数情况下,人体只能吸收L型,D型氨基酸并不能被人体直接吸收,而市场上这类药物很多都以外消旋体形式存在,因此单一对映体手性药物的获得具有重要现实意义。目前已知的对映体拆分材料有很多种,但大多能耗较高或难以实现。本文报道了一种新型的手性多孔超交联网状聚合物材料,通过一步Friedel-Crafts烷基化超交联反应,以无水Fe Cl3为催化剂,无水1,2-二氯乙烷（DCE）为溶剂,将芳香族手性添加剂与非手性共交联物通过外交联剂二甲氧基甲烷（FDA）进行交联,合成了一系列低成本、高产量、高比表面积的多孔聚合物。通过调控材料合成中手性单体与非手性单体的比例以及种类来研究原料单体组成对合成材料的影响,将合成的材料作为吸附剂或诱导剂来对氨基酸对映体进行拆分,以研究材料的手性识别性能。实验结果表明,L-苯丙氨酸:苯摩尔比为1:3时合成的L-型材料HCP-CM1M1-4具有较大的比表面积SBET=664 m2?g-1,且在30℃下对PH=7,浓度为0.1mg?m L-1的L-色氨酸吸附能力为27.70 mg?g-1,对D-色氨酸吸附能力为20.91 mg?g-1,具有显着的特异性识别功能。利用等温模型和动力学模型对HCP-CM1M1-4的色氨酸吸附过程分别进行了动力学和热力学的分析,HCP-CM1M1-4的色氨酸吸附过程更为符合Freundlich吸附等温模型和准一级动力学模型,线性拟合的相关度分别为R2=0.9946（D）,0.9913（L）和R2=0.9716（D）,0.9963（L）,该过程是一种自发进行的吸热的熵增反应。实验结果同时表明,交联单体的体积大小、苯环上可供交联的位点数以及苯环侧链组成均会影响单体Friedel-Crafts烷基化反应的程度,从而对所合成的超交联聚合物产生影响。在本实验中,不同手性添加剂与不同非手性共交联物的系列材料中手性添加剂与非手性共交联物对此类材料的合成及性能都有影响,通过改变超交联聚合物的组分,可以调控聚合物的吸附以及识别性能。
张洁[10]（2019）在《利用醛缩酶合成β-羟基-α-氨基酸催化体系的构建及优化》文中进行了进一步梳理β-羟基-α-氨基酸是一类重要的氨基酸,它和相应的氨基醇不仅本身具有重要的生物活性,还是很多合成生物活性分子的潜在手性结构单元,如抗生素、免疫抑制剂等。目前,工业上主要是通过一系列繁琐的化学方法催化合成β-羟基-α-氨基酸,化学方法不仅立体选择性不足、需要昂贵的前体或手性助剂,而且其反应污染环境。与化学法相比,酶法具有过程简单、条件温和、反应高效、选择性高等优点。在酶法合成β-羟基-α-氨基酸中,D-苏氨酸醛缩酶是重要的生物催化剂,其在合成上的应用研究多集中在化学产生的dl-syn混合物的动力学拆分而不是羟醛缩合反应。因此,从简单的前手性前体甘氨酸和醛开始的一步合成β-羟基-α-氨基酸具有重要意义。本文主要研究内容包括D-苏氨酸醛缩酶催化羟醛缩合反应体系的构建及优化、D-苏氨酸醛缩酶的固定化体系优化和双酶催化合成氨基醇方法的探索。对重组表达D-苏氨酸醛缩酶的基因工程菌进行筛选,获得催化表现相对较好的菌株E.coli BL21（DE3）/pET 28b-AcDTA进行后续实验。利用它的诱导培养物制备冻干菌粉作为生物催化剂,进行全细胞催化羟醛缩合反应,经优化后的全细胞催化工艺如下:以1%-2%添加量的干菌粉为生物催化剂,以50 mM对甲砜基苯甲醛为底物,以500 mM甘氨酸为另一底物,以100μL 5-磷酸吡哆醛为辅酶,以350μL MnCl2为金属离子,以10%的二甲基亚砜作为反应介质构成转化体系,在pH 9.5,30℃,800 rpm条件下进行反应。在优化的条件下,产物得率达到了69.84%,是未优化前的2倍。在工业应用中,廉价稳定的固定化细胞比游离细胞更有价值,因此,利用筛选出来的基因工程菌E.coli BL21（DE3）/pET 28b-AcDTA的诱导培养物制备的冻干菌粉进行聚乙烯亚胺/戊二醛（PEI/GA）交联固定化,经优化后的PEI/GA交联法体系如下:32.5 g/L冻干菌粉,6 g/L硅藻土,2%（v/v）的浓度为5%的聚乙烯亚胺先交联1 h,0.5%（v/v）的25%的戊二醛再交联30 min,在45℃,pH 8.0 0.2M磷酸钠缓冲液中进行固定化。考察固定化细胞的操作稳定性,结果表明在15批次之后其催化活力还能保持在初始的80%左右。此外,还探索了氨基醇的合成新方法——利用醛缩酶和脱羧酶双酶级联催化合成氨基醇。成功构建了表达醛缩酶的重组E.coli BL21（DE3）/pET 28b-PsDTA菌株和表达脱羧酶的E.coli BL21（DE3）/pET 28b-DAPDC菌株。两步酶法催化反应液中产物峰与标样的保留时间一致,初步证明所设想的新方法是可行的。
二、不同温度两类诱导剂形成细菌L型的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同温度两类诱导剂形成细菌L型的研究（论文提纲范文）
（1）糖基转移酶GL24971的异源表达及其过表达对灵芝多糖合成的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 真菌多糖 |
| 1.2 灵芝多糖 |
| 1.2.1 灵芝多糖的生物活性研究 |
| 1.2.2 灵芝多糖生物活性的影响因素 |
| 1.2.3 灵芝多糖的生物合成途径 |
| 1.2.4 提高灵芝多糖产量的策略 |
| 1.3 糖基转移酶的研究进展 |
| 1.3.1 细菌中的糖基转移酶 |
| 1.3.2 植物中的糖基转移酶 |
| 1.3.3 真菌中的糖基转移酶 |
| 1.4 立题意义与研究内容 |
| 1.4.1 立题意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒与引物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌重组菌株的构建 |
| 2.2.2 大肠杆菌重组菌株的表达 |
| 2.2.3 异源表达条件的优化 |
| 2.2.4 灵芝过表达质粒的构建 |
| 2.2.5 灵芝过表达质粒的转化 |
| 2.2.6 灵芝菌株的培养 |
| 2.2.7 相对转录水平测定 |
| 2.2.8 多糖产量及单糖组分的分析 |
| 2.2.9 菌体形态分析 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 大肠杆菌重组菌株的构建与表达 |
| 3.1.1 目的基因的克隆与分析 |
| 3.1.2 重组菌株的构建 |
| 3.1.3 重组酶的表达 |
| 3.1.4 表达条件的优化 |
| 3.2 灵芝过表达菌株的构建 |
| 3.2.1 重组质粒的构建与转化 |
| 3.2.2 基因相对转录水平分析 |
| 3.3 过表达葡萄糖基转移酶GL24971对菌株的影响 |
| 3.3.1 菌株形态分析 |
| 3.3.2 菌球尺寸分析 |
| 3.3.3 细胞壁的变化 |
| 3.3.4 多糖产量及单糖组成的变化 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（2）外切型肝素酶的发现、催化机制研究以及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 本章引论 |
| 1.2 肝素/硫酸乙酰肝素 |
| 1.2.1 肝素/硫酸乙酰肝素的发现及结构研究 |
| 1.2.2 肝素/硫酸乙酰肝素的生物学功能 |
| 1.2.3 肝素/硫酸乙酰肝素的应用 |
| 1.3 肝素/硫酸乙酰肝素降解酶 |
| 1.3.1 肝素酶Ⅰ(Hepase Ⅰ) |
| 1.3.2 肝素酶Ⅱ(Hepase Ⅱ) |
| 1.3.3 肝素酶Ⅲ(Hepase Ⅲ) |
| 1.3.4 其它Hepases |
| 1.3.5 HP/HS降解酶的应用 |
| 1.4 选题意义 |
| 第二章 PL15_2家族肝素酶的序列分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 PL15_2亚家族肝素酶异源表达及纯化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 培养基及试剂配置 |
| 3.3.2 基因组提取 |
| 3.3.3 BIexoHep表达载体的构建 |
| 3.3.4 PL15_2亚家族肝素酶异源表达及纯化 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 PL15_2亚家族肝素酶的活性鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 底物HP-F_(αⅢ)制备 |
| 4.3.2 PL15_2亚家族肝素酶底物专一性分析 |
| 4.3.3 PL15_2亚家族肝素酶最适反应条件分析 |
| 4.3.4 PL15_2亚家族肝素酶的酶活测定 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 PL15_2亚家族肝素酶的底物专一性分析 |
| 4.4.2 PL15_2亚家族肝素酶的最适反应条件分析 |
| 4.4.3 PL15_2亚家族肝素酶的酶活测定 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 PL15_2亚家族肝素酶的降解模式 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与试剂 |
| 5.2.1 试剂 |
| 5.2.2 仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 饱和HP13糖DP13制备 |
| 5.3.2 PL15_2亚家族肝素酶时间梯度降解HP |
| 5.3.3 PL15_2亚家族肝素酶时间梯度降解HP DP13 |
| 5.3.4 PL15_2亚家族肝素酶降解2-AB标记的HP DP13 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 PL15_2亚家族肝素酶的降解模式分析 |
| 5.4.2 PL15_2亚家族肝素酶的降解方向分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 外切型肝素酶的底物结构选择性研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与试剂 |
| 6.2.1 试剂 |
| 6.2.2 仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 HP UDP4制备 |
| 6.3.2 HP UDP4分离纯化 |
| 6.3.3 HP UDP4各组分序列测定 |
| 6.3.4 BIexoHep降解HP UDP4各组分 |
| 6.3.5 BIexoHep时间梯度降解HP UDP4 |
| 6.3.6 exoHepase降解磺达肝癸钠 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 HP UDP4制备及分离纯化 |
| 6.4.2 HP UDP4各组分序列鉴定 |
| 6.4.3 BIexoHep底物结构选择性分析 |
| 6.4.4 exoHepase降解磺达肝癸钠分析 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 BIexoHep的三维结构研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与试剂 |
| 7.2.1 菌株及质粒 |
| 7.2.2 试剂 |
| 7.2.3 仪器 |
| 7.2.4 缓冲液及培养基配置 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 BIexoHep蛋白表达纯化 |
| 7.3.2 SeMet-BIexoHep蛋白表达纯化 |
| 7.3.3 蛋白结晶及条件优化 |
| 7.3.4 晶体数据采集及结构解析 |
| 7.3.5 BIexoHep分子中金属离子的检测 |
| 7.4 结果与分析 |
| 7.4.1 BIexoHep晶体与结构解析 |
| 7.4.2 BIexoHep蛋白结构整体分析 |
| 7.4.3 BIexoHep结构与已知结构的比较 |
| 7.4.4 BIexoHep蛋白结构中金属离子的确定 |
| 7.4.5 BIexoHep的“L”型反应通道 |
| 7.4.6 底物结合位点 |
| 7.5 本章小结 |
| 第八章 BIexoHep的催化机制研究 |
| 8.1 引言 |
| 8.2 材料与试剂 |
| 8.3 实验方法 |
| 8.3.1 BIexoHep突变体与HP寡糖的共结晶与数据采集 |
| 8.3.2 BIexoHep突变体与HP寡糖的共结晶结构解析 |
| 8.3.3 突变体的构建 |
| 8.3.4 突变体活性检测 |
| 8.4 结果与分析 |
| 8.4.1 BIexoHep突变体与HP UDP4底物的复合结构 |
| 8.4.2 底物结合位点 |
| 8.4.3 BIexoHep分子改造 |
| 8.4.4 BIexoHep中Ca~(2+)作用 |
| 8.4.5 BIexoHep的外切机制 |
| 8.4.6 BIexoHep的催化机制 |
| 8.5 本章小结 |
| 第九章 BIexoHep的初步应用 |
| 9.1 引言 |
| 9.2 材料与试剂 |
| 9.2.1 试剂 |
| 9.2.2 仪器 |
| 9.3 实验方法 |
| 9.3.1 HP UDP8分离纯化 |
| 9.3.2 HP UDP8各组分不完全降解制备非还原端UDP6和UDP4 |
| 9.3.3 HP UDP8各组分及非还原端UDP6和UDP4二糖组成 |
| 9.3.4 HP UDP8各组分非还原端UDP4的还原端二糖组成 |
| 9.3.5 HP UDP8各组分MS及MS/MS鉴定 |
| 9.4 结果与分析 |
| 9.4.1 HP UDP8分离纯化 |
| 9.4.2 HP UDP8各组分序列鉴定 |
| 9.4.3 HP UDP8各组分的MS及MS/MS验证 |
| 9.5 本章小结 |
| 第十章 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 参与项目 |
| 发表论文及发明专利 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）基于代谢组学的金黄色葡萄球菌不稳定型L-型形成机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 金黄色葡萄球菌不稳定型L-型的代谢组学研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 细菌L-型形成机制研究 |
| 1.1.3 代谢组学概要及应用 |
| 1.1.4 本项目研究的目的和意义 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验试剂及材料 |
| 1.2.2 主要仪器及设备 |
| 1.2.3 实验菌株 |
| 1.2.4 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 金黄色葡萄球菌Newman株 L-型模型构建结果 |
| 1.3.2 代谢组学检测结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 金黄色葡萄球菌L-型形成过程中主要的代谢变化分析 |
| 1.4.2 不同的通路在金黄色葡萄球菌L-型形成中的变化及作用分析 |
| 1.5 结论与展望 |
| 1.5.1 结论 |
| 1.5.2 展望 |
| 第二章 gltB对金黄色葡萄球菌细菌L-型、持留菌、生物被膜形成及毒力的影响研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 研究背景 |
| 2.1.2 研究目的及意义 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验试剂及材料 |
| 2.2.2 主要实验仪器及设备 |
| 2.2.3 实验菌株及质粒 |
| 2.2.4 实验动物 |
| 2.2.5 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 金黄色葡萄球菌Newman野生株和ΔgltB L-型诱导结果 |
| 2.3.2 gltB基因回补结果 |
| 2.3.3 WT::pRAB11、ΔgltB::pRAB11和ΔgltB::pRABgltB生长特性观察 |
| 2.3.4 WT::pRAB11、ΔgltB::pRAB11和ΔgltB::pRABgltB细菌L-型形成能力观察 |
| 2.3.5 抗生素暴露试验检测WT::pRAB11、 ΔgltB::pRAB11和ΔgltB::pRABgltB持留形成能力的结果 |
| 2.3.6 WT::pRAB11、ΔgltB::pRAB11和ΔgltB::pRABgltB生物被膜形成能力检测结果 |
| 2.3.7 金黄色葡萄球菌Newman株 gltB基因敲除对小鼠毒力的影响 |
| 2.3.8 q-PCR测定毒力基因表达结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 gltB参与金黄色葡萄球菌L-型的形成分析 |
| 2.4.2 gltB调控金黄色葡萄球菌持留菌的形成 |
| 2.4.3 gltB调控金黄色葡萄球菌生物被膜的形成 |
| 2.4.4 gltB参与金黄色葡萄球菌毒力基因的表达 |
| 2.5 结论与展望 |
| 2.5.1 结论 |
| 2.5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 参与课题 |
| 致谢 |
（4）2株海洋来源链霉菌次级代谢产物多样性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1 海洋来源放线菌次级代谢产物研究进展 |
| 1.1 萜类次级代谢产物 |
| 1.2 聚酮类次级代谢产物 |
| 1.2.1 大环内酯(酰胺)类次级代谢产物 |
| 1.2.2 芳香聚酮类次级代谢产物 |
| 1.2.3 杂合聚酮类次级代谢产物 |
| 1.3 肽类次级代谢产物 |
| 1.4 生物碱类次级代谢产物 |
| 2 海洋来源放线菌次级代谢产物多样性研究策略 |
| 2.1 培养基及培养条件 |
| 2.2 添加化学诱导剂 |
| 2.3 基因组挖掘技术 |
| 2.3.1 生物信息学分析 |
| 2.3.2 基因敲除技术 |
| 2.3.3 异源表达技术 |
| 3 本文的研究内容及意义 |
| 第一章 海洋来源链霉菌FJNU027 次级代谢产物多样性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌株与指示菌 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 试剂与耗材 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 TLC显色试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 液体发酵 |
| 2.2 化学诱导剂诱导 |
| 2.3 粗提物的制备 |
| 2.4 滤纸片扩散法检测抑菌活性 |
| 2.5 TLC显色 |
| 2.6 HPLC |
| 2.7 海洋来源链霉菌FJNU027 基因组测序 |
| 2.8 海洋来源链霉菌FJNU027 基因组数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 化学诱导剂对海洋来源链霉菌FJNU027 次级代谢产物化学多样性的影响 |
| 3.2 海洋来源链霉菌FJNU027 基因组(FZ01)基本信息 |
| 3.3 海洋来源链霉菌FJNU027 次级代谢产物合成基因簇分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 第二章 海洋来源链霉菌FJNU028 次级代谢产物多样性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌株与指示菌 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 试剂与耗材 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 TLC显色试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 液体发酵 |
| 2.2 粗提物的制备 |
| 2.3 TLC检测次级代谢产物多样性 |
| 2.4 HPLC检测次级代谢产物多样性 |
| 2.5 滤纸片扩散法检测抑菌活性 |
| 2.6 筛选 |
| 2.6.1 培养基筛选 |
| 2.6.2 发酵时间筛选 |
| 2.6.3 装液量筛选 |
| 2.7 化学诱导剂诱导 |
| 2.8 海洋来源链霉菌FJNU028 基因组测序 |
| 2.9 基因组数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 培养条件筛选 |
| 3.1.1 培养基筛选 |
| 3.1.2 发酵时间筛选 |
| 3.1.3 装液量筛选 |
| 3.2 液体发酵 |
| 3.3 化学诱导剂对海洋来源链霉菌FJNU028 次级代谢产物化学多样性的影响 |
| 3.4 海洋来源链霉菌FJNU028 基因组(FZ02)基本信息 |
| 3.5 海洋来源链霉菌FJNU028 次级代谢产物合成基因簇分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 第三章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 1.1 海洋来源链霉菌FJNU027 次级代谢产物多样性研究 |
| 1.2 海洋来源链霉菌FJNU028 次级代谢产物多样性研究 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）基于CRISPR/Cas蛋白的副溶血弧菌检测方法的研究（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 Cas12a蛋白的确定和获得 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 感受态细胞和质粒 |
| 1.2 主要试剂、仪器、培养基及增菌液 |
| 2 方法 |
| 2.1 Cas12a蛋白的表达 |
| 2.2 Cas12a蛋白提取和纯化 |
| 2.3 Cas12a蛋白浓缩和保存 |
| 2.4 Cas12a蛋白浓度测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 合成质粒测序比对结果 |
| 3.2 Cas12a蛋白表达纯化和鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 向导RNA(guide RNA)的设计与获得 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 感受态细胞和质粒 |
| 1.2 主要试剂、仪器、培养基及增菌液 |
| 2 方法 |
| 2.1 gRNA序列的设计合成 |
| 2.2 gRNA提取浓缩 |
| 2.3 gRNA保存 |
| 3 结果 |
| 3.1 副溶血弧菌多序列比对分析结果 |
| 3.2 副溶血弧菌的gRNA序列结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 荧光显色与检测 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株来源 |
| 1.2 主要试剂、仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 荧光显色设计 |
| 2.2 VP基因组提取 |
| 2.3 toxR基因的扩增 |
| 2.4 CRISPR-VP检测体系 |
| 2.5 CRISPR-VP检测体系完整性验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 CRISPR-VP检测结果 |
| 3.2 CRISPR-VP体系完整性结果 |
| 4 讨论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 综述 CRISPR/Cas系统在病原体快速检测研究中的应用 |
| 参考文献 |
（6）谷氨酸棒杆菌利用木糖合成L-鸟氨酸的代谢工程改造研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 L-鸟氨酸的概述 |
| 1.1.1 L-鸟氨酸的命名 |
| 1.1.2 L-鸟氨酸的理化性质 |
| 1.1.3 L-鸟氨酸的生物功能 |
| 1.1.4 国内外L-鸟氨酸的生产现状 |
| 1.2 L-鸟氨酸的合成方法 |
| 1.2.1 酶法 |
| 1.2.2 化学合成法 |
| 1.2.3 提取法 |
| 1.2.4 微生物发酵法 |
| 1.3 产L-鸟氨酸菌种的选育 |
| 1.3.1 利用大肠杆菌合成L-鸟氨酸 |
| 1.3.2 利用谷氨酸棒杆菌合成L-鸟氨酸 |
| 1.3.3 利用酿酒酵母合成L-鸟氨酸 |
| 1.4 木质纤维素 |
| 1.4.1 木质纤维素来源与组成 |
| 1.4.2 木质纤维素的利用 |
| 1.5 谷氨酸棒杆菌对木糖的代谢探究 |
| 1.5.1 WMB途径利用木糖 |
| 1.5.2 XI途径利用木糖 |
| 1.6 本论文的研究意义与内容 |
| 1.6.1 研究意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验所需菌种与质粒 |
| 2.1.2 本章涉及引物及序列 |
| 2.1.3 所需实验试剂 |
| 2.1.4 所需实验仪器 |
| 2.1.5 培养基及配制方法 |
| 2.1.6 实验所需试剂及配制过程 |
| 2.2 实验方法及原理 |
| 2.2.1 DNA的纯化与提取 |
| 2.2.2 表达载体构建 |
| 2.2.3 质粒表达载体的转化与验证 |
| 2.2.4 发酵验证 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 木糖高效利用操纵子xylAB的来源筛选 |
| 3.2 木糖代谢操纵子xylAB的摇瓶发酵实验 |
| 3.3 优化xylAB的表达提高L-鸟氨酸产量 |
| 3.3.1 IPTG添加时间的优化 |
| 3.3.2 IPTG添加浓度的优化 |
| 3.4 编码戊糖转运蛋白araE基因整合菌的构建及摇瓶发酵实验 |
| 3.5 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)改造的摇瓶发酵实验 |
| 3.5.1 降低PEPC乙酰化 |
| 3.5.2 PEPC的脱敏 |
| 3.5.3 PEPC的改造对L-鸟氨酸产量的影响 |
| 3.6 生物素与盐酸硫胺素对L-鸟氨酸合成的影响 |
| 3.7 发酵液过程pH的优化 |
| 3.8 混合利用葡萄糖和木糖发酵产L-鸟氨酸 |
| 3.9 小结 |
| 第4章 实验结论与展望 |
| 4.1 实验结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 致谢 |
（7）铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）CHAOHU-1326纤维素合成的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蓝细菌水华及其防治 |
| 1.2 胞外多糖及其合成 |
| 1.3 生物信息学分析与蛋白质研究 |
| 1.4 细菌纤维素的应用 |
| 1.5 膜蛋白的异源表达 |
| 1.6 三亲本杂交 |
| 1.7 本研究的内容及意义 |
| 第2章 不同的L型氨基酸对铜绿微囊藻的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 藻种及生长条件 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 不同L型氨基酸对铜绿微囊藻的影响 |
| 2.1.5 藻密度的测定 |
| 2.1.5.1 标准曲线 |
| 2.1.5.2 测定藻密度 |
| 2.1.6 胞外多糖(EPS)的测定 |
| 2.1.6.1 标准曲线制备 |
| 2.1.6.2 测量方法 |
| 2.1.7 数据处理 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 标准曲线 |
| 2.2.2 L-精氨酸和L-赖氨酸对M.aeruginosa CHAOHU-1326的生长和胞外多糖合成的影响 |
| 2.2.3 L-蛋氨酸和L-异亮氨酸对M.aeruginosa CHAOHU-1326的生长和胞外多糖合成的影响 |
| 2.2.4 L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-组氨酸和L-甘氨酸对M. aeruginosaCHAOHU-1326的生长和胞外多糖合成的影响 |
| 2.3 本章小结 |
| 第3章 铜绿微囊藻CHAOHU-1326纤维素合成相关蛋白的结构与功能预测 |
| 3.1 蛋白结构与功能预测方法 |
| 3.1.1 蛋白质结构预测 |
| 3.1.2 蛋白功能预测 |
| 3.1.3 系统发育树 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 纤维素合成基因特性分析 |
| 3.2.2 蛋白二级结构预测 |
| 3.2.3 蛋白三级结构预测 |
| 3.2.4 蛋白质功能预测 |
| 3.2.5 系统发育树分析 |
| 3.3 本章小结 |
| 4.M.aeruginosa CHAOHU-1326纤维素合成酶基因的异源表达与过表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 培养基与试剂 |
| 4.1.1.1 培养基及溶液 |
| 4.1.1.2 试剂 |
| 4.1.2 菌株和质粒载体 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 蛋白表达系统和过量表达系统质粒的构建 |
| 4.1.5 目的基因的大量克隆 |
| 4.1.5.1 制备感受态细胞 |
| 4.1.5.2 质粒的抽提 |
| 4.1.5.3 M.aeruginosa CHAOHU-1326基因组DNA的提取 |
| 4.1.5.4 目的基因的克隆 |
| 4.1.5.5 PCR扩增产物的纯化 |
| 4.1.6 目的基因的TA克隆 |
| 4.1.7 重组质粒和载体质粒的酶切与连接 |
| 4.1.8 目的基因的异源表达 |
| 4.1.8.1 重组质粒转化至克隆宿主菌E.coli DH5α |
| 4.1.8.2 阳性克隆菌的筛选与验证 |
| 4.1.8.3 重组质粒转化至表达宿主菌 |
| 4.1.8.4 重组子表达产物的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳 |
| 4.1.8.5 重组蛋白的Western blot实验 |
| 4.1.9 过量表达 |
| 4.1.9.1 重组质粒转化至宿主菌E.coli DH5α |
| 4.1.9.2 三亲本杂交 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 M.aeruginosa CHAOHU-1326基因组DNA的提取 |
| 4.2.2 纤维素合成酶基因的克隆 |
| 4.2.3 阳性克隆的验证 |
| 4.2.4 载体质粒的抽提 |
| 4.2.5 重组质粒的酶切与连接 |
| 4.2.6 重组质粒的提取 |
| 4.2.7 蛋白表达体系的构建 |
| 4.2.7.1 重组质粒的转化 |
| 4.2.7.2 不同条件下的诱导表达 |
| 4.2.7.3 更换宿主菌并使用TB培养基进行诱导 |
| 4.2.7.4 更换宿主菌并使用提取膜蛋白进行Western blot验证的方法 |
| 4.2.8 三亲本杂交 |
| 4.3 本章小结 |
| 第5章 结论与建议 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）菲律宾蛤仔凝集素VpClec-1和VpClec-2基因克隆、组织表达与免疫活性的初步研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 无脊椎动物的固有免疫 |
| 1.2 凝集素研究进展 |
| 1.2.1 凝集素简介 |
| 1.2.2 动物凝集素的分类 |
| 1.2.2.1 C型凝集素 |
| 1.2.2.2 S型凝集素(半乳糖凝集素) |
| 1.2.2.3 Pentraxins |
| 1.2.2.4 P型凝集素 |
| 1.2.2.5 L型凝集素 |
| 1.3 弧菌对海水养殖造成严重危害 |
| 1.4 本研究目的和意义 |
| 1.5 本研究技术路线图 |
| 第2章 菲律宾蛤仔VpClec-1和VpClec-2 基因克隆和序列分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物准备 |
| 2.1.2 实验所用主要引物信息 |
| 2.1.3 实验所用主要试剂 |
| 2.1.4 实验所用主要仪器 |
| 2.1.5 实验所用主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菲律宾蛤仔组织样品的处理 |
| 2.2.2 菲律宾蛤仔总RNA的提取 |
| 2.2.3 菲律宾蛤仔总cDNA的合成 |
| 2.2.4 基因VpCle-1和VpClec-2的RACE技术扩增 |
| 2.2.5 基因VpCle-1和VpClec-2 的生物信息学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 基因VpCle-1和VpClec-2的c DNA全长及序列特征 |
| 2.3.2 基因VpCle-1和VpClec-2 的多序列比对特征 |
| 2.3.3 基因VpCle-1和VpClec-2 的系统进化特征 |
| 2.4 实验讨论 |
| 第3章 菲律宾蛤仔VpClec-1和VpClec-2 基因表达规律 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物准备 |
| 3.1.2 实验所用主要引物信息 |
| 3.1.3 实验所用主要试剂 |
| 3.1.4 实验所用主要仪器 |
| 3.1.5 实验所用主要试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菲律宾蛤仔组织样品的处理 |
| 3.2.2 菲律宾蛤仔总RNA的提取 |
| 3.2.3 菲律宾蛤仔总cDNA的合成 |
| 3.2.4 基因VpCle-1和VpClec-2的RACE技术扩增 |
| 3.2.5 实时荧光定量PCR法检测基因VpCle-1和VpClec-2 的表达规律 |
| 3.2.6 数据分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 基因VpClec-1和VpClec-2 在菲律宾蛤仔不同组织中的表达规律 |
| 3.3.2 基因VpClec-1和VpClec-2 在微生物刺激后的表达规律 |
| 3.4 实验讨论 |
| 第4章 菲律宾蛤仔VpClec-1和VpClec-2 免疫活性分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验样品 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 实验引物 |
| 4.1.5 实验试剂配方 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 菲律宾蛤仔组织样品处理 |
| 4.2.2 菲律宾蛤仔总RNA提取 |
| 4.2.3 菲律宾蛤仔总cDNA合成 |
| 4.2.4 菲律宾蛤仔RACE技术扩增 |
| 4.2.5 目的片段的获取 |
| 4.2.6 构建原核表达载体 |
| 4.2.7 质粒提取 |
| 4.2.8 重组蛋白rVpClec-1和rVpClec-2 的转化 |
| 4.2.9 重组蛋白rVpClec-1和rVpClec-2 的转表达与检测 |
| 4.2.10 重组蛋白rVpClec-1和rVpClec-2 的纯化 |
| 4.2.11 重组蛋白rVpClec-1和rVpClec-2 的复性与浓度测定 |
| 4.2.12 抗VpClec-1和VpClec-2 的多克隆抗体制备 |
| 4.2.13 蛋白质免疫印迹(Western-Blot) |
| 4.2.14 rVpClec-1和rVpClec-2的PAMPs结合活性分析 |
| 4.2.15 rVpClec-1和rVpClec-2 的凝菌活性分析 |
| 4.2.16 rVpClec-1和rVpClec-2 的抑菌活性分析 |
| 4.2.17 rVpClec-1和rVpClec-2 的吞噬活性分析 |
| 4.2.18 rVpClec-1和rVpClec-2 的趋化活性分析 |
| 4.2.19 数据分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 VpClec-1和VpClec-2 重组蛋白的获得和多抗制备 |
| 4.3.2 抗VpClec-1和VpClec-2的PAMPs结合、凝菌和抑菌活性 |
| 4.3.3 rVpClec-1和rVpClec-2 的吞噬和趋化活性 |
| 4.4 实验讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（9）超交联多孔聚合物的制备及手性识别性能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 手性拆分研究进展 |
| 1.1.1 手性简介 |
| 1.1.2 对映体拆分意义 |
| 1.1.3 手性拆分方法 |
| 1.2 手性多孔材料的类型及制备方法 |
| 1.2.1 手性金属有机骨架(CMOF) |
| 1.2.2 手性共价有机框架(CCOF) |
| 1.2.3 手性介孔二氧化硅(CMS) |
| 1.2.4 分子印迹聚合物(MIP) |
| 1.2.5 多孔聚合物微/纳米球(PPS) |
| 1.2.6 已有制备手性多孔材料方法的局限性 |
| 1.3 手性多孔材料的制备新方法探索 |
| 1.4 超交联聚合物(HCPs)概述 |
| 1.4.1 超交联聚合物(HCPs)简介 |
| 1.4.2 超交联聚合物(HCPs)研究进展 |
| 1.4.3 超交联聚合物(HCPs)制备方法 |
| 1.5 本课题的提出及研究内容 |
| 第2章 实验部分 |
| 2.1 实验材料及仪器设备 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器及设备 |
| 2.2 交联单体结构式 |
| 2.3 三苯基苯的合成 |
| 2.4 超交联手性多孔材料的合成 |
| 2.5 表征方法 |
| 2.5.1 傅里叶红外光谱 |
| 2.5.2 扫描电子显微镜 |
| 2.5.3 X射线光电子能谱分析 |
| 2.5.4 核磁共振波谱仪 |
| 2.5.5 热重分析 |
| 2.5.6 孔隙及表面积分析 |
| 2.5.7 紫外分光光度计 |
| 2.5.8 圆二色光谱仪 |
| 2.6 标准曲线的测定 |
| 2.7 手性识别性能的研究方法 |
| 2.7.1 选择性吸附实验 |
| 2.7.2 重结晶实验 |
| 2.8 解吸实验 |
| 2.9 本章小结 |
| 第3章 不同比例手性苯丙氨酸与苯交联材料的制备及拆分性能研究 |
| 3.1 不同比例苯丙氨酸与苯交联材料的合成及表征 |
| 3.1.1 不同比例苯丙氨酸与苯交联材料的合成 |
| 3.1.2 不同比例苯丙氨酸与苯交联材料的表征 |
| 3.2 吸附条件选择 |
| 3.2.1 色氨酸紫外标准曲线的绘制 |
| 3.2.2 PH对 HCP-CM1M1-4 吸附色氨酸影响 |
| 3.2.3 材料用量对HCP-CM1M1-4 吸附色氨酸影响 |
| 3.2.4 接触时间对HCP-CM1M1-(4,5)吸附色氨酸影响 |
| 3.2.5 温度对HCP-CM1M1-4 吸附色氨酸影响 |
| 3.2.6 初始浓度对HCP-CM1M1-4 吸附色氨酸影响 |
| 3.3 HCP-CM1M1-4 的吸附动力学研究 |
| 3.4 HCP-CM1M1-4 的吸附热力学研究 |
| 3.5 HCP-CM1M1-4 的等温吸附研究 |
| 3.6 HCP-CM1M1-4 吸附L-Trp的吸附机理 |
| 3.7 对映体选择性吸附性能 |
| 3.7.1 HCP-CM1M1-(2-5)对三种芳香族氨基酸的选择性吸附 |
| 3.7.2 HCP-CM1M1-4(D/L)对色氨酸的选择性吸附 |
| 3.8 HCP-CM1M1-4(D/L)对三种氨基酸重结晶 |
| 3.9 本章小结 |
| 第4章 手性添加剂与共交联物结构对手性超交联多孔材料合成及选择性吸附性能影响 |
| 4.1 不同手性氨基酸与苯交联材料的制备及表征 |
| 4.1.1 不同手性氨基酸与苯单体交联材料的合成 |
| 4.1.2 不同手性氨基酸与苯单体交联材料的表征 |
| 4.1.3 手性拆分性能研究 |
| 4.1.4 手性添加剂结构对合成材料的吸附及手性识别性能的影响 |
| 4.2 苯丙氨酸与不同共交联物交联材料的制备及表征 |
| 4.2.1 三苯基苯的合成与表征 |
| 4.2.2 苯丙氨酸与不同共交联物交联材料的合成 |
| 4.2.3 苯丙氨酸与不同共交联物交联材料的表征 |
| 4.2.4 手性拆分性能研究 |
| 4.2.5 非手性共聚物结构对合成材料的孔结构影响 |
| 4.2.6 共交联物结构对合成材料的吸附及手性识别性能的影响 |
| 4.3 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文和取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）利用醛缩酶合成β-羟基-α-氨基酸催化体系的构建及优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 羟醛缩合反应 |
| 1.2 β-羟基-α-氨基酸 |
| 1.2.1 β-羟基-α-氨基酸简介 |
| 1.2.2 羟基-α-氨基酸的合成 |
| 1.3 苏氨酸醛缩酶 |
| 1.3.1 醛缩酶的简介 |
| 1.3.2 苏氨酸醛缩酶 |
| 1.4 固定化 |
| 1.4.1 固定化的概念 |
| 1.4.2 固定化方法 |
| 1.4.3 固定化细胞载体 |
| 1.5 氨基酸脱羧酶 |
| 1.5.1 氨基酸脱羧酶的简介 |
| 1.5.2 二氨基庚二酸脱羧酶 |
| 1.6 本文研究背景、内容及意义 |
| 1.6.1 研究背景及意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 研究目标 |
| 第二章 D-苏氨酸醛缩酶催化不对称合成D-对甲砜基苯基丝氨酸 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 质粒 |
| 2.2.2 试剂与材料 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 缓冲液 |
| 2.2.5 主要仪器及设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 基因挖掘 |
| 2.3.2 重组E.coli BL21(DE3)/pET28b-DTA菌株构建 |
| 2.3.3 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-DTA的诱导表达与纯化 |
| 2.3.4 高效液相色谱检测方法 |
| 2.3.5 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-DTA的筛选 |
| 2.3.6 标准曲线绘制 |
| 2.3.7 游离酶催化不对称合成D-对甲砜基苯基丝氨酸 |
| 2.3.8 底物对甲砜基苯甲醛溶解度的探索 |
| 2.3.9 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-AcDTA催化不对称合成D-对甲砜基苯基丝氨酸 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 重组E.coli BL21(DE3)/pET28b-DTA菌株构建 |
| 2.4.2 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-DTA的诱导表达与纯化 |
| 2.4.3 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-DTA的筛选 |
| 2.4.4 标准曲线测定 |
| 2.4.5 游离酶催化不对称合成D-对甲砜基苯基丝氨酸 |
| 2.4.6 底物对甲砜基苯甲醛溶解度的探索 |
| 2.4.7 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-AcDTA催化不对称合成D-对甲砜基苯基丝氨酸 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 聚乙烯亚胺/戊二醛交联法固定化重组表达醛缩酶的大肠杆菌细胞 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 固定化菌体 |
| 3.2.2 试剂与材料 |
| 3.2.3 培养基 |
| 3.2.4 缓冲溶液 |
| 3.2.5 主要仪器及设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 工程菌的发酵培养 |
| 3.3.2 固定化细胞的反应体系 |
| 3.3.3 固定化体系优化 |
| 3.3.4 固定化菌体的催化体系 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 冻干菌粉除水率 |
| 3.4.2 固定化体系优化 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 双酶催化合成2-氨基-1-[4-(甲基磺酰基)苯基]-1,3-丙二醇新方法的探索 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 质粒 |
| 4.2.2 试剂与材料 |
| 4.2.3 培养基和缓冲溶液 |
| 4.2.4 主要仪器及设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 基因挖掘 |
| 4.3.2 重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET28b-Ps DTA和 E.coli BL21(DE3)/pET28b-DAPDC的构建 |
| 4.3.3 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-Ps DTA和 E.coli BL21(DE3)/pET28b-DAPDC 的诱导表达 |
| 4.3.4 重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-Ps DTA催化不对称合成2-氨基-2-羧基-1-[4-(甲砜基)苯基]-1,3-丙二醇 |
| 4.3.5 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-DAPDC催化不对称合成2-氨基-1-[4-(甲砜基)苯基]-1,3-丙二醇 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET28b-Ps DTA和 E.coli BL21(DE3)/pET28b-DAPDC的构建 |
| 4.4.2 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-Ps DTA和 E.coli BL21(DE3)/pET |
| 4.4.3 重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-Ps DTA催化不对称合成2-氨基-2-羧基-1-[4-(甲砜基)苯基]-1,3-丙二醇 |
| 4.4.4 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-DAPDC催化不对称合成2-氨基-1-[4-(甲砜基)苯基]-1,3-丙二醇 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 1 作者简历 |
| 2 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 3 参与的科研项目及获奖情况 |
| 学位论文数据集 |
四、不同温度两类诱导剂形成细菌L型的研究（论文参考文献）
- [1]糖基转移酶GL24971的异源表达及其过表达对灵芝多糖合成的影响[D]. 陈云. 江南大学, 2021(01)
- [2]外切型肝素酶的发现、催化机制研究以及应用[D]. 张庆冬. 山东大学, 2021(11)
- [3]基于代谢组学的金黄色葡萄球菌不稳定型L-型形成机制研究[D]. 唐恬. 兰州大学, 2021(09)
- [4]2株海洋来源链霉菌次级代谢产物多样性研究[D]. 李伟. 福建师范大学, 2020(12)
- [5]基于CRISPR/Cas蛋白的副溶血弧菌检测方法的研究[D]. 王群. 中国疾病预防控制中心, 2020(03)
- [6]谷氨酸棒杆菌利用木糖合成L-鸟氨酸的代谢工程改造研究[D]. 高歌. 华东理工大学, 2020(01)
- [7]铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）CHAOHU-1326纤维素合成的研究[D]. 丁娇. 山东大学, 2020(11)
- [8]菲律宾蛤仔凝集素VpClec-1和VpClec-2基因克隆、组织表达与免疫活性的初步研究[D]. 张健宁. 鲁东大学, 2020(01)
- [9]超交联多孔聚合物的制备及手性识别性能研究[D]. 张文盼. 哈尔滨工程大学, 2020(05)
- [10]利用醛缩酶合成β-羟基-α-氨基酸催化体系的构建及优化[D]. 张洁. 浙江工业大学, 2019(02)