酵母DNA损伤响应中ATR激酶及其相关复合物的结构研究

论文摘要

细胞在生长的过程中会遇到各种来自外界或内部的压力,如辐射、化学分子、病毒、氧化自由基等等,这些压力条件很容易造成基因组DNA的损伤。DNA的损伤会造成很多不良后果,如细胞坏死,在高等生物中还有可能造成癌变。为了应对各种不利因素对基因组稳定性带来的影响,真核生物进化出了复杂的DNA损伤响应的机制,修复受损的DNA,调控细胞周期,或者诱导细胞启动凋亡程序。作为一种重要的组蛋白修饰形式,H2B的单泛素化（酵母中K123位点,人源K120位点）广泛地参与DNA复制、基因的转录与表达、DNA损伤修复及异染色质维持等生物过程。组蛋白修饰是染色质调控的重要方式之一。酿酒酵母H2B的泛素化由Rad6/Bre1（泛素结合酶Rad6,泛素连接酶Bre1）复合体进行催化。到目前为止还不清楚Rad6/Bre1如何结合泛素泛素激活酶Uba1和核小体。我们内源性地从酵母细胞中分别纯化得到了 Uba1和Rad6/Bre1复合体,并体外组装了 Uba1-Rad6-Bre1复合物和核小体-Rad6-Bre1复合物。三维重构发现,Rad6/Bre1稳定结合在Uba1上部,首次发现了泛素化修饰的三个酶形成了稳定的复合物,暗示了体内也存在三种酶相互结合的可能性。这完全不同于已知的由泛素结合酶单独结合泛素激活酶并接受泛素后再结合泛素连接酶的结合方式,所以Uba1、Rad6和Bre1之间传递泛素的方式可能是独特的。此外,Rad6/Bre1也能稳定地结合核小体,首次获得了完整的Rad6/Bre1与底物结合的复合物,证明了体外组装完整核小体-Rad6-Bre1复合物的可能性,为后续进一步解析核小体-Rad6-Bre1复合物的冷冻电镜结构奠定了基础。在DNA损伤响应通路中,最关键的两种调控蛋白是ATM（ataxia-telangiectasia mutated）和 ATR（ATM-and Rad3-related）激酶,位于损伤响应信号传导的最上游。ATR在DNA的单链损伤响应以及稳定复制叉结构中起到核心的调控作用,是细胞不可缺少的关键激酶。目前已有人源ATR/ATRIP（ATR interacting protein）复合物以及来源于酿酒酵母的ATR/ATRIP同源蛋白Mec1/Ddc2的高分辨率冷冻电镜结构。但是目前解析的结构是未激活状态的ATR/ATRIP结构。由于ATR下游调控了众多细胞进程,所以其活性受到多种因子的严格调控。但是目前并不知道ATR/ATRIP和其他多种因子之间的相互作用方式,对于ATR的激活机制还并不清楚。我们解析了来源于裂殖酵母的ATR/ATRIP同源蛋白Rad3-Rad26在体内羟基脲（Hydroxyurea,HU）诱导激活状态下的8.8A冷冻电镜结构。HU能够抑制dNTP池从而造成DNA复制的停滞,引起DNA复制胁迫。Rad3-Rad26的整体结构与酿酒酵母Mec1/Ddc2—样呈蝴蝶状,但是其结构稳定性更低,体现在其HEAT区域的结构非常灵活,具有多种构象状态。激酶结构域结构相对较为稳定,在不同物种间保持更高的保守性。通过体外活性检测证实了HU的体内激活效果。结合体外孵育和电镜分析,发现多个DNA损伤检验点复合物蛋白能不同程度地体外激活Rad3-Rad26。并能与Rad3-Rad26在体外稳定相互作用形成复合物。结合检验点复合物蛋白后Rad3-Rad26的构象分布发生一定程度的变化,开放状比例减少,蝴蝶状比例增,尤其是完整的检验点复合物组分能最显著地影响Rad3-Rad26的活性和构象分布。脂肪酸的合成和代谢与细胞的生长状态密切相关。脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FAS）能体内合成软脂酸和硬脂酸。最近的研究表明ATR参与调控细胞代谢和运动,而FAS也与基因组的稳定性密切相关。但是两者之间的关联还不得而知。我们在内源性纯化Rad3-Rad26时,意外发现了有脂肪酸合成酶FAS稳定的共纯化。我们解析了共纯化的FAS和单独纯化的FAS的冷冻电镜结构,分辨率分别为4.7A和5.1A。两种FAS的整体结构与酿酒酵母中FAS的结构高度保守,为D3对称的桶形结构。通过比较共纯化的FAS和单独FAS的结构,我们发现FAS的底物传递核心ACP（acyl carrier protein）结构域具有明显的差异。在共纯化的FAS中,ACP稳定结合在AT（acyltransferase）结构域底物入口处,而单独纯化的FAS中无法清晰指认ACP结构域的位置。通过荧光成像发现FAS在正常条件和多种DNA损伤应激条件下都分布在细胞质中,没有进入细胞核;但是Rad3可以同时分布在细胞核与细胞质当中,并且在DNA损伤应激条件下细胞质分布的细胞比例明显提高。因此Rad3与FAS的相互作用有可能是通过Rad3的出核实现的。本论文中,我们初步探究了酿酒酵母中H2B泛素化过程中修饰酶及其与核小体底物之间的结合方式。首次得到了三种泛素修饰酶的复合物以及修饰酶与核小体的复合物,表明了 Rad6不需要与Bre1解离即可结合Uba1,暗示了可能的新的泛素传递方式,初步实现了核小体与Rad6/Bre1的体外组装,为进一步探究H2B泛素化修饰的机制提供了基础。解析了裂殖酵母中ATR/ATRIP的同源蛋白Rad3-Rad26在HU体内激活状态下的中等分辨率的冷冻电镜结构,发现了Rad3-Rad26独有的高度动态以及二体相互作用界面的变化,加深了对Rad3-Rad26的结构认识。体外研究了检验点复合物相关成员对Rad3-Rad26的调控,指示了进一步体外组装检验点复合物需要RPA、9-1-1、Rad4以及ATPγs。发现了 Rad3-Rad26与FAS的共纯化以及Rad3-Rad26对FAS结构的稳定作用,暗示了 Rad3-Rad26可能直接参与了脂肪酸合成的调控,将DNA损伤响应与脂肪酸合成更直接地联系起来。

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第一章绪论

1.1 DNA损伤响应

1.1.1 组蛋白H2B泛素化修饰

1.1.2 PIKK（Phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases）家族

1.1.3 ATR的结构研究

1.1.4 ATR的功能研究

1.1.5 脂肪酸合成酶FAS与脂肪酸代谢

1.1.6 脂肪酸合成酶结构研究

1.1.7 FAS与DNA损伤响应

1.2 冷冻电镜技术

1.2.1 结构生物学

1.2.2 电子显微技术在生物学中的应用

1.2.3 生物电镜样品的制备

1.2.4 电子显微三维重构技术的原理和方法

1.2.5 直接电子探测器（Direct detection device,DDD）的应用

1.2.6 图像处理技术

1.3 研究目的和意义

第二章实验材料与方法

2.1 克隆构建

2.1.1 Rad3-2xFlag构建

2.1.2 TAP-Rad3/TAPm-Rad3构建

2.1.3 Fasl-2x Flag构建

2.1.4 TAPm-Ssb1构建

2.1.5 Rad4-6His构建

2.1.6 GST-Rad4构建

2.1.7 Uba1-TAPm构建

2.1.8 Rad6-TAPm构建

2.1.9 Ub-6His构建

2.1.10 荧光标签克隆构建

2.2 细胞培养

2.2.1 酵母的培养

2.2.2 大肠杆菌的培养

2.2.3 酵母的羟基脲（HU）诱导

2.3 蛋白质纯化

2.3.1 酵母内源性纯化

2.3.2 重组表达蛋白的纯化

2.4 激酶活性的测定

2.5 体外孵育实验

2.5.1 H2B泛素化修饰酶的孵育

2.5.2 检验点复合物组装孵育

2.6 荧光成像实验

2.7 DAPI染色

2.8 电镜观察与数据收集

2.8.1 负染样品的制备

2.8.2 冷冻样品的制备

2.8.3 负染数据的收集

2.8.4 冷冻数据的收集

2.9 电镜照片的数据处理

2.9.1 负染数据的二维分析

2.9.2 负染数据的RCT重构

2.9.3 冷冻数据的重构

第三章 H2B泛素化修饰复合物的初步结构

3.1 泛素激活酶Uba1的纯化

3.2 泛素激活酶Uba1的三维结构

3.3 Rad6/Bre1复合物的纯化

3.4 Uba1-Rad6-Bre1复合物三维结构

3.5 Nuc207-Rad6-Bre1复合物三维结构

第四章 Rad3-Rad26的结构

4.1 Rad3-Rad26复合物的纯化

4.2 Rad3-Rad26的负染三维结构

4.3 Rad3-Rad26的体内激活

4.4 Rad3-Rad26激活状态的冷冻电镜结构

4.4.1 冷冻电镜数据的收集和预处理

4.4.2 单颗粒的挑选

4.4.3 数据的处理与重构

4.5 Rad3-Rad26与Mec1-Ddc2的比较

第五章检验点复合物的组装

5.1 检验点复合物相关蛋白的纯化

5.1.1 RPA的纯化

5.1.2 Rad9-Hus1-Rad1（9-1-1）的纯化

5.1.3 Rad4的纯化

5.2 Rad3-Rad26体外孵育

5.2.1 Rad3-Rad26与激活肽段的体外孵育

5.2.2 Rad3-Rad26与检验点蛋白的体外孵育

5.3 Rad3-Rad26的体外激活

第六章脂肪酸合成酶（FAS）共纯化与结构解析

6.1 FAS的纯化

6.2 Rad3-Rad26与FAS的定位

6.3 FAS的冷冻电镜结构

6.3.1 共纯化FAS的冷冻电镜结构

6.3.2 单独FAS的冷冻电镜结构

6.4 两种FAS的结构比较

第七章结论与展望

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘升

导师: 蔡刚

关键词: 损伤响应,泛素化修饰,脂肪酸合成酶,冷冻电镜

来源: 中国科学技术大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国科学技术大学

分类号: Q78

DOI: 10.27517/d.cnki.gzkju.2019.000189

总页数: 134

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