家蚕染色体分散型着丝粒蛋白的功能研究

论文摘要

生物体从受精卵发育成个体的过程中,会不断地进行细胞分裂,而着丝粒在细胞分裂过程中发挥着重要的作用。真核生物中存在着两种形式的着丝粒:一种是单着丝粒,又称为局部型着丝粒;另一种是多着丝粒,又称为分散型着丝粒。而我们研究的鳞翅目模式生物家蚕,它的着丝粒属于分散型着丝粒。在细胞分裂的过程中,遗传物质被平均分配到两个子细胞,着丝粒与纺锤体在这一过程中发挥着重要的作用。着丝粒的功能是在前中期维持姐妹染色体的粘合,中期附着纺锤丝,后期参与染色体的迁移行为。目前对单着丝粒生物（例如哺乳动物）的着丝粒结构以及着丝粒蛋白种类已经研究得比较清楚,但对分散型着丝粒的研究则相对较少。对家蚕而言,目前有关着丝粒的研究仅停留在对其蛋白种类的基因组鉴定上。最近的研究报道了家蚕外部着丝粒的结构,其外部结构的着丝粒蛋白比较保守,主要由Mis12复合物与Ndc80复合物组成,复合物的蛋白种类和互作方式也有一定的研究。但是着丝粒内部结构的着丝粒蛋白的种类相对变化较大,在不同的物种中有不同的种类。CenpA蛋白在哺乳动物中发挥着十分重要的作用,可以标记染色体着丝粒的位置（着丝粒中组蛋白H3的变体称为CenH3,在哺乳动物中被命名为CenpA）。CenpA在家蚕等鳞翅目昆虫中却是缺失的,并且与CenpA蛋白互作的CenpC蛋白也是缺失的。本研究主要以研究家蚕着丝粒蛋白在细胞分裂过程中发挥的功能及家蚕着丝粒蛋白被其互作蛋白调控的具体过程为目的。通过研究,得出以下的结果:（1）家蚕着丝粒蛋白结构的功能分析为了研究已知着丝粒蛋白的功能及其在有丝分裂过程中的作用。我们首先对已知的着丝粒蛋白进行了亚细胞定位分析,发现BmCenpI蛋白在有丝分裂间期定位在细胞质中,在分裂期的中期定位在染色体的两侧,在后期同样定位在染色体上;而BmCenpM、BmCenpL、BmCenpN蛋白在间期主要定位在细胞核中,在中期定位于染色体的两侧,在后期定位在染色体上。4种蛋白在分裂期的中期和后期均定位在染色体上,暗示了其具有着丝粒蛋白的功能。为了进一步研究这些蛋白的功能,我们采用细胞干涉技术将这些基因沉默表达,发现在细胞分裂中期缺少这些着丝粒蛋白时,微管蛋白的排列会发生紊乱,染色体不能整齐地排列在赤道板上。这些结果表明着丝粒蛋白在细胞有丝分裂过程中发挥着非常重要的作用。（2）家蚕着丝粒蛋白CenpN复合物鉴定为了研究是否存在其他的蛋白参与着丝粒的功能,我们采用质谱技术鉴定了与BmCenpN发生相互作用的蛋白。通过免疫沉淀技术富集了与BmCenpN蛋白相关的复合物,进而我们对免疫沉淀后的样品进行了质谱检测,在对照组中鉴定到了34种蛋白,在实验组中鉴定到了166种蛋白,而实验组中与BmCenpN蛋白有特异相互作用的蛋白有142种。这些蛋白在生物学进程方面主要参与细胞过程和代谢过程,在分子功能方面主要具有核酸和蛋白结合功能。我们从中筛选出9种参与有丝分裂以及与细胞周期相关的蛋白进行了相互作用验证:微管蛋白β-Tubulin,热激蛋白同源物HSC70,肌动蛋白解聚因子ADF1,F-肌动蛋白加帽蛋白α亚基FCPa,F-肌动蛋白加帽蛋白β亚基FCPb,泛素连接酶E2 Ube2,泛素羧基末端水解酶UchX1,Cdc2相关激酶CDK10,泛素激活酶E1 Uba2。分别对9种蛋白和BmCenpN蛋白进行了细胞共定位和免疫共沉淀实验。其中共定位实验表明BmUba2、BmFCPa、BmUchX1、BmFCPb、BmCDK10在间期、中期、后期均可以与目的蛋白BmCenpN共定位,而BmADF1、BmUbe2、BmTubulin、BmHSC70这4种主要在中期和后期可以发生共定位。进一步通过免疫共沉淀实验证实了9种蛋白与目的蛋白BmCenpN可以发生相互作用。（3）家蚕CenpN互作蛋白的调控功能为了研究9种互作蛋白对BmCenpN蛋白功能的影响。我们首先合成了9种目的蛋白的双链RNA,RT-PCR结果显示合成的双链RNA能够特异性地降低目标基因的表达,说明合成的双链RNA可以在家蚕SID I细胞中发挥作用。进一步我们在稳定表达EGFP-BmCenpN的细胞系中,将互作蛋白的基因干涉掉。结果发现与对照相比,9个实验组中EGFP-BmCenpN的表达发生了很大变化,尤其干涉掉HSC70基因后其表达量显著减少,而且当干涉掉HSC70基因后导致EGFP-BmCenpN蛋白可以定位在细胞核和细胞质中。有意思的是,当干涉掉HSC70基因后,同时用蛋白酶体抑制剂MG-132处理细胞,能够显著恢复EGFP-BmCenpN的表达量,Western Blot的结果进一步验证了荧光实验的结果。这些结果表明家蚕HSC70能够影响着丝粒蛋白BmCenpN的亚细胞定位和稳定性。

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摘要

ABSTRACT

第1章文献综述

1.1 着丝粒的种类及研究概况

1.2 着丝粒的结构组成及研究概况

1.2.1 着丝粒的结构域

1.2.2 着丝粒组成蛋白和DNA的研究

1.3 着丝粒的功能及研究概况

1.4 脊椎动物中着丝粒蛋白的研究概况

1.5 分散型着丝粒生物的研究概况

1.5.1 分散型着丝粒线虫的研究

1.5.2 分散型着丝粒昆虫的研究

第2章引言

2.1 研究背景及目的意义

2.2 研究内容

2.3 研究技术路线

第3章家蚕着丝粒蛋白的组成分析

3.1 实验材料与仪器

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验仪器与试剂

3.1.3 试剂配制

3.2 实验方法

3.2.1 细胞复苏

3.2.2 家蚕卵巢细胞系BmN4-SID I的培养

3.2.3 转染与稳定细胞系的构建

3.2.4 着丝粒蛋白的亚细胞定位

3.2.5 干涉

3.2.6 免疫荧光

3.2.7 细胞冻存

3.3 结果与分析

3.3.1 家蚕着丝粒蛋白的亚细胞定位

3.3.2 家蚕着丝粒蛋白缺少导致染色体发生紊乱

3.4 讨论

第4章家蚕着丝粒蛋白CenpN复合物鉴定

4.1 实验材料与仪器

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验仪器与试剂

4.1.3 试剂配制

4.2 实验方法

4.2.1 LR重组载体的构建

4.2.2 免疫沉淀

4.2.3 Western Blot检测

4.2.4 银染

4.2.5 FASP法蛋白质酶解

4.2.6 共定位实验

4.2.7 CO-IP 实验

4.2.8 LC-MS/MS质谱联用检测

4.2.9 数据库搜索

4.3 结果与分析

4.3.1 家蚕着丝粒蛋白复合物的分离

4.3.2 家蚕着丝粒蛋白复合物的鉴定

4.3.3 家蚕CenpN特异互作蛋白的功能分析

4.3.4 家蚕CenpN特异互作蛋白的筛选

4.3.5 家蚕CenpN互作蛋白的基因克隆

4.3.6 家蚕CenpN与互作蛋白的共定位分析

4.3.7 家蚕CenpN与互作蛋白的Co-IP分析

4.4 讨论

第5章家蚕CenpN互作蛋白的调控功能

5.1 实验材料与仪器

5.1.1 实验材料

5.1.2 实验仪器与试剂

5.1.3 溶液配制

5.2 实验方法

5.2.1 家蚕c DNA的获取

5.2.2 合成双链

5.2.3 双链RNA干涉

5.2.4 干涉后基因的半定量检测

5.2.5 干涉后Western Blot检测EGFP-CenpN的表达量

5.2.6 泛素化检测

5.3 结果与分析

5.3.1 干涉双链的合成

5.3.2 家蚕CenpN互作蛋白的基因干涉

5.3.3 家蚕CenpN互作蛋白影响EGFP-CenpN表达

5.3.4 HSC70 影响EGFP-CenpN表达及细胞定位

5.3.5 HSC70 影响EGFP-CenpN表达

5.3.6 过表达HSC70 不影响EGFP-CenpN表达

5.3.7 蛋白酶体抑制剂MG-132 处理能够恢复EGFP-BmCenpN表达

5.3.8 蛋白酶体抑制剂MG-132 处理能够恢复FLAG-BmCenpN表达

5.4 讨论

第6章综合与结论

参考文献

在读期间发表论文及参研课题

致谢

附表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李冰倩

导师: 李志清

关键词: 家蚕,着丝粒,泛素化修饰

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西南大学

分类号: Q26

总页数: 85

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