刘士杰[1]2006年在《盐酸克伦特罗在动物组织中的残留分布及代谢规律》文中研究说明本文系统研究了盐酸克伦特罗(Clenbuterol,CL)在猪尿液、血液和组织中的残留分布及代谢规律。并通过放射性同位素~3H标记试验,研究了CL在小白鼠体内的残留分布及代谢规律,进一步验证CL在猪体内残留分布及代谢规律。初步建立了猪眼睛中CL的高效液相色谱(HPLC)检测方法。 本实验选用24头健康育肥猪(平均70kg左右,公母各半),随机分成两组,分别饲喂CL日粮(5mg/kg和10mg/kg),连续30天。在用药的第1、2、3、4、6、8、10、14、20和29天,每剂量组任选3头,采集尿样和血液样品;10mg/kg剂量组于用药的第2、4、6、10、14天分早(8:00～9:00)、中(12:00～1:00)、晚(5:00～6:00)叁点,每点随机采集6份尿样;在停药的第0、3、7、14天每剂量组任选3头猪屠宰,采集尿液、血液、眼睛、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏和肌肉(叁角肌、第1～3腰椎肌、股二头肌)样品。采用高效液相色谱法测定样品中的药物残留。检测结果显示:①CL口服吸收很快,饲喂第1天即可从尿液中检出,用药期有两个残留高峰分别是饲喂第3天和第20天,残留浓度随用药剂量增加升高;同一天不同时间点尿液中CL残留不同,中午、傍晚尿液中CL残留浓度显着高于早上尿液中的残留浓度,中午和傍晚尿液中残留差异不显着,但中午有高于傍晚的趋势。②猪饲喂CL后第1天即可从血液中检出CL,给药期血液中CL残留浓度总体呈上升趋势,尿液中残留浓度随用药剂量增加而升高。③停药0天,CL在尿液、血液、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏和肌肉(叁部分)中残留分别为338.6ng/g、54ng/g、243 ng/g、514.7ng/g、116.8ng/g、66.5ng/g、13.8ng/g、11.5ng/g、12.1ng/g(5mg/kg剂量组),1417ng/g、104ng/g、352ng/g、825.7ng/g、183.8ng/g、135.2ng/g、19.4ng/g、18.7ng/g、18.1ng/g(10mg/kg剂量组)。④不同组织中CL代谢速度不同,除肌肉停药第7天不可检出外(低于检测限0.5ng/g),其它组织停药14天仍可检出,残留浓度分别为15.1ng/g、1.2ng/g、16.1ng/g、17.1ng/g、4ng/g、4.6ng/g(5mg/kg剂量组),21.8ng/g、5.5ng/g、41.2ng/g、39.6ng/g、9.6ng/g、8.3ng/g(10mg/kg剂量组)。研究表明:CL易在猪体内残留,分布广泛且代谢较为缓慢,不同组织代谢速率不同。 另外,本文还对~3H标记的CL在小白鼠体内的残留分布及代谢规律进行了研究,试验结果表明:CL在小白鼠体内分布广泛,在所取的13种样品中,均有CL总残留,不同的组织残留浓度不同,代谢速度也不相同。与对猪进行的实验相比,基本一致。在小鼠实验中CL在毛发残留较高,代谢最慢,而且药物在毛发中存在稳定,所以是检测CL非常理想的靶器官(组织)。小白鼠是色素缺乏性动物,但在眼睛中CL残留仍然较高,代谢较慢,仅次于毛发,所以眼睛也是检测CL较为理想的靶器官(组织)。 最后,初步建立了猪眼睛中CL高效液相色谱(HPLC)检测方法,制作了标准曲线,线性范围为0.01μg/ml-10μg/ml,方法的检测限为2.5ng/g,定量限为5ng/g,回收率为70%～110%,变异系数3.95%～8.42%,用该方法检测猪眼睛中CL残留结果如下:①停药0天,猪眼睛中CL残留浓度远远高于其它组织,两剂量组CL残留浓度分别高达1716.1ng/g和2981.5ng/g。②CL在猪眼睛中代谢较为缓慢,停药第14天两剂量组残留浓度仍高达107.2ng/g和385.2ng/g。由此可知,CL在眼睛中具有高残留、慢消除的特点,进而表明眼睛是
严莉[2]2004年在《盐酸克伦特罗在动物组织中的残留分布及其毒性的研究》文中指出本试验用酶联免疫吸附法(ELISA)研究了盐酸克伦特罗(CLB)在动物各组织的残留状况及对动物的毒性。试验采用小白鼠和猪两种动物。采用单因子试验设计，小白鼠试验分为4个试验组，猪分为3个试验组，分别灌注不同剂量的CLB后，观察动物服用CLB后的异常表现，并在小白鼠试验30d，猪试验35d后，进行解剖病理分析和残留检测。 试验结果显示：用酶联免疫吸附法(ELISA)对CLB进行检测，方法简单，容易掌握，耗时少(5～6h)，可满足县级以下单位对CLB的检测。CLB在动物各组织的残留规律为：小白鼠的肌肉组织和肝脏、肺脏、肾脏等内脏器官的CLB残留量与用药剂量呈极显着正相关(P＜0.01)，猪肌肉组织和各内脏器官的CLB残留量有随用药剂量增大而增大的趋势。不论CLB剂量的高低，同一剂量组机体的组织器官中肺脏和肝脏有较高的残留。小白鼠试验3组的肺脏和肝脏残留量分别为：263.3ng／g和242.8ng／g；猪试验2组的肺脏和肝脏残留量分别为：415.5ng／g和350.8ng／g；肝脏、肺脏都具有残留量高，体积大，采样既方便又容易，运送与处理都较方便的优点，是可食组织中检测盐酸克伦特罗残留的主要器官。CLB对动物造成了行为、体态的异常，同时造成肝脏、肺脏、脾脏、肾脏和淋巴结等组织器官发生轻微肿大、膨胀、间质水肿，出血和炎症等肉眼可见的病理变化。 上述结果可以用于屠宰过程，通过观察动物是否发生体态、行为的异常和肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、淋巴结等组织器官的病理变化，剔除可疑胴体，再辅以ELISA检测，能有效地防止漏检错判和中毒事件的发生。
李颖[3]2013年在《肉羊主要器官中盐酸克伦特罗检测方法及代谢残留规律的研究》文中研究表明盐酸克伦特罗（CL），是一种β-受体激动剂，因其具有促进动物生长和提高瘦肉率的作用，常被非法用于动物养殖。CL易在动物组织内残留蓄积，人食用残留CL的动物组织会导致食物中毒或引起潜在的健康危害。近几年的例行监测发现CL的使用从猪扩大到肉牛和肉羊，但关于肉羊养殖过程中CL监测技术研究较少。本研究针对CL在肉羊体内代谢残留行为不明，蓄积消除规律不清，监管靶标选择困难等技术问题，从检测方法，测量不确定度评定、残留代谢规律和残留预测模型等方面进行系统研究。（1）应用LC-MS/MS建立了肉羊眼睛、心脏、肺脏、肾脏和脾脏等主要器官中CL残留的检测方法。样品经提取后，利用混合型阳离子固相萃取柱净化，氨化甲醇溶液（95/5，V/V）洗脱，氮吹浓缩后流动相定容，应用LC-MS/MS检测。在优化条件下，方法的线性范围为5ng/mL～200ng/mL；CL在眼睛和肺脏的检出限为0.01μg/kg，定量限为0.03μg/kg；在心脏和脾脏组织中的检出限为0.07μg/kg，定量限为0.23μg/kg；在肾脏中的检出限为0.03μg/kg，定量限为0.10μg/kg。在样品基质中添加不同浓度水平的CL（浓度范围为5-20ng/mL），测得CL在眼睛中的回收率为99.93%～102.07%，相对标准偏差（RSD）低于3.95%；在心脏中的回收率为95.92%～108.50%，RSD低于8.35%；在肺脏中的回收率为95.60%～109.00%，RSD低于6.90%；在肾脏中的回收率为91.04%～109.83%，RSD低于2.22%；在脾脏中回收率为91.46%～120.38%，RSD低于3.51%。本方法回收率高，重现性良好，能够满足肉羊个组织器官中CL代谢残留检测的要求。（2）对休药期肉羊主要器官中CL的残留规律进行了研究。选择24只肉羊(30kg±5kg)进行试验，在饲料中添加CL的含量为50μg/kg，连续给药21d，停药后于0、1、2、3、7、14d分别随机选3只羊屠宰，采集眼睛、心脏、肾脏、肺脏、脾脏等器官组织，用建立的LC-MS/MS方法测定。结果表明，CL在肉羊眼睛中消除较慢，而在脾脏中消除速度是最快。停药第14d眼睛中CL的浓度为53.50±10.57μg/kg，而在脾脏组织中停药第3d CL残留量即检测不到（低于检出限0.07μg/kg）。故眼睛组织可作为肉羊产品中监测CL非法使用的靶标。（3）研究了停药时间与组织器官中CL残留的函数关系，初步探讨了CL在肉羊主要器官中的残留规律。采用SPSS统计学软件，以停药时间为自变量，建立了停药时间与组织器官中CL残留的函数关系，构建了CL在肉羊主要器官中的残留消除模型。结果表明，函数的拟合优度好，R2均大于0.80，符合统计学和回归分析要求。对预测值与组织实测值进行T检验，结果显示二者差异不显着（P>0.05），表明利用该CL残留消除模型接近真实水平。（4）以羊眼睛中CL测定为代表，对用LC-MS/MS法测定肉羊器官中CL残留量进行了测量不确定度的分析评价。通过分析测量不确定度，找出对羊眼睛中CL测定准确性影响较大的因素，从而采取措施提高检测结果的可信度。依据标准不确定度的评定方法，结合实验方法建立的数学模型，对影响样品测定结果的不确定度来源进行分析，计算出总体的合成标准不确定度和扩展不确定度。总合成标准不确定度u（Qx）=3.4μg/kg，取包含因子为k=2，扩展不确定度U（P=95%）=6.8μg/kg，测量结果表述为63.4±6.8μg/kg。结果表明，工作曲线计算羊眼睛中CL的上机液浓度引出的相对不确定度对总合成标准不确定度的贡献最大，因此，在检测过程中这个环节需引起重视。
苗虹[4]2010年在《食品及生物材料中β-激动剂和β-阻断剂残留检测技术研究及污染评价》文中认为瘦肉精,又称克伦特罗,是一系列β-激动剂,具有促进动物生长和提高瘦肉率的作用,经常被违禁添加在动物饲料中；而另一类化学结构类似的β-阻断剂则用于动物运输过程中,防止动物因应激而造成的突然死亡。食用动物中违禁使用β-激动剂或β-阻断剂会导致其在动物体内的残留,摄入β-激动剂或β-阻断剂残留的动物组织,存在食物中毒的风险或引起潜在的健康危害。β-激动剂和β-阻断剂还是《世界反兴奋剂条例》中规定的禁止在体育赛事中使用的兴奋剂。因此针对β-激动剂和β-阻断剂建立一套快速有效的风险评估预警体系势在必行。本研究建立了由检测、监测、暴露评估以及风险预警的全套技术支撑体系,使得食品安全中亟待解决β-激动剂和β-阻断剂的风险评估预警成为可能。主要研究内容及研究结果如下：1.动物性食品中β-激动剂及β-阻断剂多组分残留的液相色谱-串联质谱检测方法建立经样品制备和检测参数的优化后,分别采用混合型阳离子固相萃取技术和分子印迹(MIP)固相萃取技术进行动物性食品的前处理,以甲醇和含0.1%甲酸的水溶液为流动相,梯度洗脱；采用ESI源正离子模式电离,叁级质谱选择离子监测(CRM)模式进行扫描,以9种氘代β-激动剂为内标,建立高效液相色谱-线性离子阱质谱(HPLC-LIT-MS3)测定动物性食品中25种β-激动剂及23种β-阻断剂残留的检测方法。采用AtlantisT3-150 mm(或Supelco Ascentis(?) express Rp-Amide-150 mm)色谱柱进行色谱分离,甲醇和含0.1%甲酸的水溶液为流动相梯度洗脱。测定的线性范围为5～200μg/L,相关系数(r)大于0.99。在动物性食品中两种方法的检出限分别在0.015～0.3μg/kg之间(MCX)和0.001～0.06μg/kg之间。(MIP)。以空白猪肉、猪肝和猪肾样品为代表基质进行了加标回收试验,MCX净化方法的加标水平为5、10、20μg/kg,MIP净化方法的加标水平为1、2、4μg/kg,各化合物的回收率在40.7%～131.9%之间,RSD在0.9%～30.0%,两种方法的精密度及准确度均较好。对阳性样品进行测定,获得良好的确证结果。建立的方法具有很高的灵敏度,而且定性准确、定量可靠,可以用于动物肌肉、肝脏和肾脏组织中β-激动剂和β-阻断剂类药物残留的确证检测。2.生物样品中β-激动剂及β-阻断剂残留的液相色谱-串联质谱检测方法建立在上述工作基础上,分别采用基质固相分散技术(MSPD)和MIP技术建立了尿液中25种β-激动剂及23种β-阻断剂的HPLC-LIT-MS3测定方法。2种不同的样品前处理技术分别为：(1)MSPD技术：尿液样品以叁氯乙酸酸解后离心,上清液经ExtrelutTM硅藻土以乙酸乙酯进行洗脱净化；(2)MIP技术：尿液样品经β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶酶解后调pH7.0,直接以混合型β-激动剂及β-阻断剂的MIP固相萃取柱净化。进行了方法学验证试验,各化合物定量的线性范围为5～200μg/L,在尿液中两种方法的检出限分别在0.001～0.13μg/L(MSPD)和0.001～0.06μg/L(MIP)。采用MSPD净化的方法的空白尿液加标水平为5、10和20μg/L,各化合物回收率在38.8%～133.4%之间,RSD在1.5%～38.1%；采用MIP净化的方法的空白尿液加标水平为0.5、1和2μg/L,各化合物回收率在40.4%～125.6%之间,RSD在1.0%～33.3%。以阳性尿液样品验证了方法的实用性。建立的检测方法的灵敏度很高,检测限可达ppt级,而且该方法简便快速,完全能满足人或动物尿液中的β-激动剂和β-阻断剂的定性和定量分析。3.北京市动物性食品中β-激动剂和β-阻断剂药物的污染监测及评价采用建立的液相色谱-串联质谱法对北京市场采集的94份鸡肉、猪肝和猪肾样品以及北京市2009年总膳食研究的动物性食品混样样品进行了β-激动剂和β-阻断剂残留的监测。在良好的质量控制保证下,1份市场采集的猪肾样品中检出沙丁胺醇,含量为31.38μg/kg。其他样品中均未检出β-激动剂和β-阻断剂残留。表明仍存在对食品动物违禁使用β-激动剂的情况。北京市2009年总膳食样品中未检出β-激动剂和β-阻断剂残留,说明北京市场动物性食品中不含有β-激动剂和β-阻断剂。但鉴于β-激动剂及β-阻断剂均为我国禁止用于食用动物的兽药,其违禁使用时有发生,为确保我国食品的安全性,因此加强动物性食品中禁用β-激动剂和β-阻断剂的多残留监测实属必要。4.我国动物性食品中β-激动剂和β-阻断剂的残留状况、溯源分析及膳食安全性评价采用建立的液相色谱-串联质谱法,对我国2007年总膳食研究的动物性膳食样品中β-激动剂和β-阻断剂残留进行了检测。在48份动物性膳食混合样品中,有2份样品(江西肉类混样和上海肉类混样)同时检出克伦特罗和莱克多巴胺,克伦特罗的污染水平远高于莱克多巴胺,未检出β-阻断剂的残留。通过溯源分析发现克伦特罗和莱克多巴胺残留主要来源于猪制品-猪肉和猪肝。由此可见,在我国食用动物的饲养中仍存在β-激动剂的违禁使用。以检出的克伦特罗和莱克多巴胺残留量进行膳食暴露评价：克伦特罗全国平均暴露量为0.0827μg/人/天,占ADI的32.8%。莱克多巴胺的全国平均膳食暴露量很低,为0.0055μg/人/天,占ADI的0.009%,因此不会对人体健康产生风险。而对于肉类样品中检出克伦特罗的上海和江西来说,其膳食暴露量较高,分别为0.4764μg/人/天和0.4783μg/人/天,占ADI的189.0%和189.8%,这说明当地居民存在食用β-激动剂和β-阻断剂的健康风险。由克伦特罗的极端暴露量分析可见,极端暴露风险较大的是猪肝制品。由于动物的内脏器官特别是肝脏是β-激动剂如克伦特罗等的体内代谢的主要残留场所,因此为降低β-激动剂和β-阻断剂的健康风险,建议不要一次性大量食用动物内脏。
陈颖[5]2013年在《茶对降低小鼠体内盐酸克伦特罗的影响》文中进行了进一步梳理本文从小鼠体重、肝脏脏器系数以及血清中盐酸克伦特罗(CLB)的残留量叁方面,研究了绿茶、红茶和普洱茶对于降低小鼠体内盐酸克罗的功能影响。初步建立了血清中少量CLB残留量的高效液相色谱(HPLC)检测方法。试验以清洁级昆明种小鼠为试验对象,分为茶汤预防组、茶汤清除组和对照组等叁组进行试验。茶汤预防组小鼠首先分别进行7d的绿茶、红茶和普洱茶茶汤喂饮,然后进行连续4d的上午CLB灌胃,下午断尾取血；茶汤清除组小鼠灌胃CLB10d,分别日常饮用各茶类低、中、高浓度的茶汤,在第11d停止灌胃CLB的同时停止饮茶,在试验期的第1d、2d、3d、4d、6d、8d、10d、11d、12d和13d采集血样。小鼠体重隔天称取,试验结束当天处死小鼠并且称取小鼠肝脏,计算小鼠肝脏的脏器系数。采用高效液相色谱法检测血样中的CLB残留量。通过试验得到以下结论：1、小鼠血清中的CLB残留量在24h中呈现一个波浪形变化；CLB残留量在灌胃后3h出现峰值,将灌胃后3h取血作为之后试验的采血时间点,保证所取血量中的CLB残留量为试验当日最大值；血样中CLB残留量的测定方法,回收率在75%-100%之间,切实可行。2、CLB染毒小鼠异常亢奋,较空白对照组和阴性组小鼠更为行动敏捷；通过预先7d饮用绿茶、红茶和普洱茶,能有效预防小鼠体重在CLB染毒期间的快速增加；绿茶、红茶和普洱茶能显着控制CLB染毒小鼠的体重,且PT2%> GT2%>BT2%;饮用绿茶能有效保护CLB染毒小鼠的肝脏,小鼠肝脏脏器系数比较：2%GT-Protect> CK-GT2%>CK>2%GT-Clear>CLB。3、CLB残留量在2%GT-Protect、2%BT-Protect、2%PT-Protect组小鼠血清中的变化趋势基本一致；茶汤通过保护小鼠的肾脏和肝脏,提高小鼠解毒能力和排尿频率,从而有效预防CLB在血清中的蓄积,减少CLB对小鼠肝细胞的损害；普洱茶预防CLB在体内蓄积的功效优于绿茶和红茶。4、整个灌胃期,小鼠体内CLB残留量在灌胃第1天出现最大值,在灌胃第8天出现最小值,双峰现象说明CLB在小鼠体内具有时间积累性；绿茶、红茶和普洱茶均能有效降低小鼠体内的CLB残留量；灌胃第10天,比较CLB对照组和阳性组小鼠体内的CLB残留量,其中高浓度茶汤的清除作用最为显着。通过以上研究表明,绿茶、红茶和普洱茶均能有效控制CLB染毒小鼠的体重,积极预防CLB在小鼠体内的大量蓄积以及显着清除小鼠体内残留CLB,保护小鼠肝脏免受CLB的损害,因此通过本次小鼠模型的建立并试验研究,饮茶可能对人体预防CLB积累有一定意义。
李慧[6]2005年在《克伦特罗在猪组织和尿液中的残留消除规律及其在猪毛发中检测方法（GC/MS）的研究》文中认为本论文系统研究了克伦特罗在猪组织和尿液中的残留及消除规律,初步研究制定了克伦特罗在猪毛发中的气谱-质谱联用检测方法。 24 头健康猪(69±2.0kg),随机分为两组,公母各半,分别饲喂添加5mg/kg 和10mg/kg 盐酸克伦特罗的日粮,连续30 天,在用药的第1、2、3、4、6、8、10、14、20、29 天,每组任选3 头猪,采集尿液。于停药后0、3、7、14 天,每组任选3 头猪,以颈静脉放血处死,采集尿液、血液、肝脏、肾脏、肌肉(前腿肌、背最长肌和后腿肌)。采用液-固萃取的方法提取尿液及组织中的克伦特罗,高效液相色谱法测定药物的浓度。结果显示:①猪混饲CL 后第1 天即能从尿液中检出,在用药的第3 天和第20 天分别出现CL 排泄的高峰,饲喂10mg /kg CL 组尿液中排泄CL 的浓度高于5mg/kg 组。②停药0天,5mg/kg 组与10mg/kg 组尿液中CL 浓度分别为338.6 ng/ml 和1417 ng/ml,肝脏中CL浓度分别为243ng/g 和352ng/g,肾脏中CL 浓度分别为116.8ng/g 和183.8ng/g,血清中CL 浓度分别为54ng/ml 和104ng/ml,肌肉中CL 浓度分别为12.4ng/g 和18.7ng/g。③停药7 天,5mg/kg 组与10mg/kg 组尿液中CL 浓度分别为19.7ng/ml 和45.1ng/ml,肝脏中CL 浓度分别为35.9ng/g 和51.9ng/g,肾脏中CL 浓度分别为12.6ng/g 和19.3ng/g,血清中CL 浓度分别为8.5ng/ml 和15.5ng/ml,肌肉中已检测不到(低于0.5 ng/g)。④停药14天,5mg/kg 组与10mg/kg 组尿液中CL 浓度分别为15.1ng/ml 和21.8ng/ml,肝脏中CL浓度分别为16.1ng/g 和41.2ng/g,肾脏中CL 浓度分别为4ng/g 和9.6ng/g,血清中的CL浓度分别为1.2ng/ml 和5.5ng/ml,肌肉中检测不到(低于0.5 ng/g)。上述结果表明,克伦特罗在尿液和肝脏中的残留量高并且消除缓慢,因而可作为监测克伦特罗的适宜靶组织。另外,该药在肌肉中的残留消除规律还可作为安全评价的依据。初步建立了猪毛发样本中CL 的测定方法。采用0.1M 盐酸提取猪毛发中的克伦特罗,应用LC-WCX 固相萃取柱净化,乙醇-浓氨水(98∶2,V∶V)洗脱,经衍生,以选择离子监测方式(m/z=86,187,243,262)对CL 进行气相色谱质谱定性/定量分析。在猪毛发(0.05μg/g~5μg/g)中的平均添加回收率为89.6%~109%,相对标准偏差(RSD)在4.76%~6.74%之间,该方法的定量限和检测限分别为0.05mg/kg 和0.01mg/kg.。本方法回收率高,重复性好,符合残留分析及相关研究的要求。
崔晓明[7]2004年在《动物组织中兽药残留分析及检测》文中研究说明近年来食品中的兽药残留在国内外已成为一个影响广泛和颇具争议的问题，它与公众的健康息息相关，也直接关系到产业界的经济利益。食品中兽药的残留水平一般为1μg~1mg或更低，并且检测中的干扰因素多，因此开发简便、高效的样品制备与前处理方法，以及具有高灵敏度和选择性的检测方法是十分必要和紧迫的。 本文共分叁部分：第一章为相关工作的背景及文献综述；第二章为动物组织中盐酸克伦特罗的气相色谱检测方法的研究及应用；第叁、四、五章分别采用不同的检测方法测定动物组织中游离棉酚的含量。具体内容为：第一章概述了动物性食品中兽药残留分析方法的进展，主要介绍了超声波辅助提取、固相萃取、基质固相分散技术和超临界流体萃取等样品前处理技术以及这些方法在兽药残留分析中的应用，并对气相色谱、高效液相色谱和免疫分析法等常用检测方法做了简要概述，最后阐述了本研究工作的目的和意义。第二章建立了气相色谱法直接测定动物组织中盐酸克伦特罗残留量的分析方法。用稀盐酸做提取液，经超声波辅助从动物组织中提取盐酸克伦特罗，再通过C18固相萃取小柱净化及BSTFA衍生化处理样品。最后采用PTE-5毛细管柱分离，电子捕获检测器检测。方法的最低检测限为1.0μg/kg，通过分析方法学评价该方法测定结果准确可靠，可以作为动物组织中盐酸克伦特罗的筛选性检测方法。最后将本方法应用于乌鲁木齐市及周边地区动物性食品中盐酸克伦特罗残留量的调查研究报告中，取得了满意的结果。第叁章提出了用高效液相色谱测定动物组织中游离棉酚含量的方法。用70%丙酮水溶液为提取液，经旋转蒸发浓缩样品。最后以BDS HYPERSIL C18
王选年[8]2002年在《β-肾上腺素受体激动剂克伦特罗的免疫特性及中毒病理学研究》文中研究说明β-肾上腺素受体激动剂盐酸克伦特罗(Clenbuterol,CL)具有促进动物生长、增加肌肉含量、降低胴体脂肪蓄积、提高瘦肉率的作用，俗称“瘦肉精”。但是，CL在动物体内存在广泛的积累性残留，对食用者的安全造成潜在的危害，急性中毒事件屡有发生。到目前为止，没有任何国家允许CL作为生长促进剂用于食品动物的生产之中，欧盟、美国FDA及我国政府都制定了严格的残留标准。在我国盐酸克伦特罗的违禁使用和急性中毒事件一直是公众关注的焦点问题。建立有效的残留监督检测体系、提高人们对CL中毒危害的认识是治理其非法使用的有效措施。 本文在研究药物半抗原免疫特性的基础上以CL结合抗原免疫Balb／c小鼠，应用杂交瘤技术制备抗CL单克隆抗体，以单克隆抗体膜层析技术设计CL快速检测EIA试剂盒和快速检测试纸条，并应用GC-MS和HPLC等确证分析法确证EIA分析方法的灵敏性、特异性和稳定性。同时，进行了CL在猪尿液中的消除规律和实验动物中毒的病理学研究。 用重氮化法将半抗原CL偶联于载体蛋白BSA和OVA，形成偶联抗原BSA-CL和OVA-CL。以BSA-CL免疫8周龄Balb／c小鼠，以OVA-CL检测免疫鼠血清抗CL效价(＜10~(-4))。使免疫鼠脾细胞与NSO浆细胞瘤细胞融合产生分泌CL单抗的杂交瘤细胞。筛选出C-4G1、C-2H6、C-2D6和C-4C9共4株高敏感性和高特异性杂交瘤生产单抗，其单抗的间接ELISA效价分别为5×10~(-5)、3×10~(-4)、6×10~(-4)、2×10~(-5)；同种型分别为IgG_1／κ、IgG_1／κ、IgG_(2a)／κ、IgG_(2a)／λ。C-4G1的亲和力常数K=1.68×10~8 L／mol，C-2H6的亲和力常数K=1.3×10~8 L／mol。经WestGold蛋白质印迹鉴定单抗与CL特异性结合。 应用C-4G1和C-2H6单克隆抗体以间接ELISA模式设计竞争性CL快速检测试剂盒(CL-Kit)。CL-Kit标准曲线呈典型的S型，符合4参数Logit曲线拟合。CL单抗对CL的IC50为7．94llgllnL，沙丁胺醇旧b）的IC50为1000ng／InL，肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素和来克多巴胺的IC刘均36400ng／InL；与Sb的交叉反应性为0．79％，与异丙肾上腺素的交叉反应性为0．12％，而与肾上腺素、去甲肾上腺素、来克多巴胺、各类抗生素及多种维生素均无交叉反应性。该试剂盒线性检测范围为0．5八，相关系数R乙0．996。各标准品的吸光值变异系数为2．3％刁．6％。试剂盒测定回收率在91见时 见，批内变异系数均小于20呢，批间变异系数均小于10％。试剂盒在保存期内稳定。 胶体金点免疫结合法（Dot Inunnobinding Assay）检测 CL抗原的最小检测浓度为 1．25 pg／mL，最小检测量可达 2．5 pg。试纸条测定 CL抗原含量的敏感度可达 1．9 ngllnL。 建立了猪尿液中CL残留检测的GC－MS测定方法和饲料中CL含量测定的HPLC测定方法。并以此方法确证了CL－Xit的敏感性、特异性和稳定性。 用CLXit测定饲喂CL饲料的猪尿液样品中CL含量，采用药物代谢动力学计算程序分析CL在猪尿液中的消除规律。表明CL在机体中积累性残留较大，连续饲喂 Zld，停药 12h后尿液中 CL残留量达 181．15ng／InL。停药22d后尿液中含量降至＊ 以下。CL在尿液中呈双相性消除，消除半衰期飞。＝18h，TI。。＝108h。 CL结合抗原免疫家兔门g只，免疫l必次）可导致全身瘫痪症状门历人中毒小鼠（腹腔注射 CL sing／kg，。l咖，连用 50d）发生实质性坏死性心肌炎变化。显微镜检查，心肌细胞颗粒变性、断裂、溶解，肌纤维横纹消失。大部分。O肌表现为团块状无结构均质样的凝固性坏死。坏死部位深染伊红。在肌纤维间发生淋巴细胞浸润。
鞠慧丽[9]2008年在《盐酸克伦特罗快速检测试剂盒的研制与开发》文中认为盐酸克伦特罗(CL)是β-兴奋剂的一种,具有促进动物生长,提高饲料利用率,改善瘦肉率的作用。但该药排泄速率慢,易蓄积在动物组织中,引起消费者发生急性中毒,目前已被大多数国家列为违禁药,然而,CL滥用和残留的问题仍然存在,灵敏、有效的残留检测方法是控制残留的基本手段。目前国际上多使用ELISA方法作为CL快速检测的筛选方法,国内检测机构一般采用进口试剂盒进行检测,成本高,到货周期长,售后没有保证,但是在这一领域的国产试剂盒产品又存在着稳定性差,假阴性、假阳性率高等缺点,从而使国产试剂盒在这方面迟迟未打开市场。本实验着力于研制出稳定性好,假阴/阳性率低,能够与国外产品相媲美的CL快速检测试剂盒。本试剂盒采用间接竞争ELISA方法,通过优化条件得到最终反应条件为:包被抗原约0.2μg/mL,抗体工作浓度约为0.059μg/mL,总体反应时间为90min,酶标二抗的稀释倍数为1:1000。建立的标准曲线的线性范围为0-8ng/mL,IC50平均为1.0ng/mL,最低检测限(LOD)达0.1ng/mL,标准点批内变异系数为1.28-13.19%,批间变异系数在5-15%之间,试剂盒保存期在1年以上。与荷兰(ED)试剂盒比对实验表明,本试剂盒的回收率在80%-120%之间,高于ED试剂盒的50%-80%的样品回收率,同时本试剂盒可以保持稳定1年以上,这与ED试剂盒相当,领先于国内试剂盒。总之,在标准点符合程度、曲线参数、实际样品回收率等方面与ED试剂盒的测量结果相当,部分指标甚至优于ED试剂盒,从而证明了本试剂盒的可用性和替代国外试剂盒的可能性。
王宏飞[10]2004年在《抗克伦特罗单克隆抗体的研制及其检测试剂盒的初步应用》文中认为克伦特罗(Clenbuterol，CL)是一种人工合成的β2-肾上腺素受体激动剂，能显着促进动物生长、提高饲料报酬和增加瘦肉率，因而曾广泛使用。但其超量使用对人与动物的肝、肾等内脏器官有一定的毒副作用，故现在各国均禁止其在畜牧生产上应用。 目前克伦特罗的检测技术主要有色谱技术和免疫分析技术。色谱技术样品处理繁琐费时，成本高，而且需要有经过专门训练的专业人员来操作复杂的仪器设备，不适合大批量样品的筛选。作为一种快速、灵敏、特异的检测方法，酶联免疫吸附测定正逐渐应用于药物的残留检测。本研究通过抗原的合成和单克隆抗体的研制，建立了克伦特罗的ELISA检测方法，研制出克伦特罗检测试剂盒。 以重氮化法将克伦特罗小分子与载体蛋白偶联，制备免疫抗原，以此免疫Balb／c小鼠，并取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2／0)融合，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法筛选，最终获得了3株能分泌抗克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞。特异性试验证明3C_3单抗有很强的特异性，仅与试验的克伦特罗反应，而不与四环素、沙丁胺醇、肾上腺素等反应，而2F_(12)，4F_3单抗不仅能与克伦特罗反应，而且还能与沙丁胺醇反应，但不与肾上腺素、四环素等反应。 以重氮化法将克伦特罗与卵清蛋白偶联，将其作为包被抗原(CL-OVA)，包被酶标板，克伦特罗为竞争的半抗原，然后将待检样品与定量的抗克伦特罗单克隆抗体反应，通过酶标抗体作用和底物显色，建立了竞争ELISA检测克伦特罗的方法，研制出克伦特罗快速检测试剂盒。实验结果表明，竞争ELISA最佳包被抗原浓度为0.72μg／孔，抗CL-McAb最佳工作浓度为1：1000和1：2000，酶标二抗的工作浓度为1：30000，可测最适范围为1～100ng／mL，最小检测量为0.1ng／mL，克伦特罗单抗对克伦特罗的半数抑制浓度为0.43ng／mL，与沙丁胺醇的交叉反应率为4.3％，与四环素等其它肾上腺素激动剂没有交叉反应，试剂盒的回收率在87％～105％，批内和批间的变异系数分别为2.16％，7.59％。试剂盒在保存期内稳定。
参考文献：
[1]. 盐酸克伦特罗在动物组织中的残留分布及代谢规律[D]. 刘士杰. 中国农业科学院. 2006
[2]. 盐酸克伦特罗在动物组织中的残留分布及其毒性的研究[D]. 严莉. 四川农业大学. 2004
[3]. 肉羊主要器官中盐酸克伦特罗检测方法及代谢残留规律的研究[D]. 李颖. 中国农业科学院. 2013
[4]. 食品及生物材料中β-激动剂和β-阻断剂残留检测技术研究及污染评价[D]. 苗虹. 中国疾病预防控制中心. 2010
[5]. 茶对降低小鼠体内盐酸克伦特罗的影响[D]. 陈颖. 南京农业大学. 2013
[6]. 克伦特罗在猪组织和尿液中的残留消除规律及其在猪毛发中检测方法（GC/MS）的研究[D]. 李慧. 新疆农业大学. 2005
[7]. 动物组织中兽药残留分析及检测[D]. 崔晓明. 新疆大学. 2004
[8]. β-肾上腺素受体激动剂克伦特罗的免疫特性及中毒病理学研究[D]. 王选年. 中国人民解放军军需大学. 2002
[9]. 盐酸克伦特罗快速检测试剂盒的研制与开发[D]. 鞠慧丽. 华中科技大学. 2008
[10]. 抗克伦特罗单克隆抗体的研制及其检测试剂盒的初步应用[D]. 王宏飞. 扬州大学. 2004
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