一、细菌自动培养仪厌氧培养的临床应用（论文文献综述）
中国医疗保健国际交流促进会临床微生物与感染分会,中华医学会检验医学分会临床微生物学组,中华医学会微生物学和免疫学分会临床微生物学组[1]（2022）在《血液培养技术用于血流感染诊断临床实践专家共识》文中研究表明血液培养是临床微生物学实验室最重要的检查之一, 是诊断血流感染、菌血症的金标准。专家组对血液培养技术辅助血流感染诊断的临床应用进行了讨论, 并对一些关键问题给出了共识性观点。共识包括术语、适应证、标本采集与运送、分析中检测、分析中问题处理、分析后相关工作和结果解释、分析后会诊和诊断标准7个部分, 近百条建议。希望能为临床诊断和处置、实验室工作提供合理、实用的帮助。
张鹤营[2]（2021）在《具有抗菌活性的新型喹恶啉-N1, N4-二氧化物的设计、合成和作用机制研究》文中研究指明喹恶啉-N1,N4-二氧化物早期作为抗菌药应用于兽医临床。近些年研究表明,喹恶啉类化合物具有广泛的药理活性,如抗肿瘤、抗病毒、抗结核杆菌、抗虫及抗真菌活性。特别是针对抗结核杆菌和抗原虫活性的新型喹恶啉类化合物的发现及结构改造成为药物化学领域研究的热点之一。研究表明喹恶啉类化合物在生物体内氧化还原酶的作用下产生氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）,ROS进攻细菌DNA双链造成DNA双链发生断裂,最终导致细菌死亡。喹恶啉类化合物具有较强的厌氧选择活性,其在还原性酶的作用下,得到一个单电子被还原,并释放出羟基自由基（OH·）。OH·是生物体内的一种ROS,它能够通过修饰DNA双链进而降解DNA,这也是目前研究所得到的最为认可的喹恶啉类化合物的作用方式。对喹恶啉类化合物抗结核杆菌活性的研究较为广泛,但对其抗结核杆菌的作用机制研究较少。目前基于结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tb）作用机制的研究主要集中在巨噬细胞内各种通路的调控作用,其中包括ROS和自噬。ROS可以进攻M.tb细胞膜上的电子传递链（Electron transport chain,ETC）,干扰其能量代谢及稳态;高水平的ROS也能诱导细胞自噬,通过自噬可以抑制并清除胞内感染的M.tb。本课题首先运用药效团融合的药物设计策略,保留喹恶啉-N1,N4-二氧化物药效团,分别重点对喹恶啉环C2位和C6位进行结构改造,获得新型喹恶啉-N1,N4-二氧化物衍生物。对获得的目标化合物进行抗菌活性评价,建立构效关系。然后从ROS、DNA合成与修复以及诱导细胞自噬等方面阐明喹恶啉-N1,N4-二氧化物发挥抗菌作用的作用方式。1.新型噻唑烷酮-喹恶啉-N1,N4-二氧化物的设计、合成与活性研究本课题拟通过结构改造得到新型喹恶啉-N1,N4-二氧化物,完善该类化合物的构效关系,并筛选出潜在的先导化合物为喹恶啉类化合物研究与发展奠定基础。研究表明喹恶啉环的C2和C7位取代基对该类化合物的抗菌活性影响较大,并且本实验室前期也对该类化合物的构效关系进行了分析,同样发现C2位取代基对其抗菌活性影响较大。近些年来,化合物的结构改造主要借助药效团融合、化合物骨架跃迁和电子等排等方法,从而获得具有潜在活性的先导化合物。噻唑酮环广谱的抗菌活性为本课题化合物的设计改造提供了思路,本课题采用药效团融合的策略设计了C2位含有不同取代噻唑酮环的化合物,在经过氧化反应、Beirut反应、水解反应、醛胺缩合及环化缩合反应后得到26个新型噻唑烷酮-喹恶啉-N1,N4-二氧化物（TZN1～26）。采用微量肉汤稀释法和MABA法分别测定化合物TZN1～26的抗菌、抗真菌和抗结核杆菌活性,结果表明:TZN4、TZN5、TZN10、TZN11、TZN15、TZN16、TZN20、TZN21、TZN25和TZN26对革兰氏阳性菌表现出显着的抗菌活性,较喹乙醇抗菌活性提高2～8倍,如化合物TZN20和TZN21对金黄色葡萄球菌ATCC29213的MIC为16μg/m L。化合物TZN19-26对白色念珠菌（C.albicans,ATCC90028）、热带念珠菌（C.tropicalis,ATCC7349）,A.fumigatus（3.5352）和C.neoformans（2.3201）具有一定的抗菌活性（MIC≤8μg/m L）。TZN20、TZN21、TZN25和TZN26对M.tb具有显着的活性（MIC=1.56μg/m L）。分析后发现,在喹恶啉环C7位或苯环C4位引入F原子或Cl原子后能增加化合物活性,当取代甲基或甲氧基后会明显降低化合物活性。通过建立3D-QSAR模型分析化合物的构效关系。结果表明,在喹恶啉环C7位和苯环的C4位取代体积大、电负性强或亲水性基团有利于提高喹恶啉类化合物的抗菌活性;在喹恶啉环C7位引入正电性基团会显着降低化合物的亲和力,导致化合物抗菌活性的降低;在喹恶啉环C2位侧链引入亲水性基团和氢键供体基团同样会提高化合物的抗菌活性。2.新型含氮杂环-喹恶啉-N1,N4-二氧化物的设计、合成与活性研究目前对喹恶啉环C6位的结构改造较少,仅有少量研究表明在C6位引入卤素原子或甲基基团可以提高化合物的抗菌活性,未见更多的结构改造,导致该位置构效关系的空缺。本课题采用药效团融合策略重点针对C6位进行结构改造,引入多种含氮杂环,同时在C2位取代酯基或酰基,C3位引入甲基或三氟甲基,C7位取代氟原子,在经过一系列氧化反应、Beirut反应及亲核取代反应后得到33个新型含氮杂环-喹恶啉-N1,N4-二氧化物（NCH1～33）。采用微量肉汤稀释法和MABA法分别测定化合物NCH1～33的抗菌活性和抗结核杆菌活性,结果显示:化合物NCH1～33对大肠杆菌ATCC25922的抗菌活性较差,仅NCH5、NCH6和NCH25的MIC值为4～8μg/m L;化合物NCH16、NCH20、NCH24、NCH28和NCH29对耐药大肠杆菌的抗菌活性与标准菌相比,并未有明显降低的现象,说明耐药大肠杆菌对这些化合物并未产生明显的耐药性,也间接表明喹恶啉类化合物的抗菌作用方式可能与氟喹诺酮类药物有所差异。NCH1～33对胸膜肺炎放线杆菌ATCC27090的MIC低至0.25μg/m L,对副猪嗜血杆菌HPS0165的MIC低至1μg/m L。对于金黄色葡萄球菌ATCC29213,化合物的MIC低至0.5μg/m L,较乙酰甲喹抗菌活性提高256倍。对于临床分离耐药金葡菌,化合物的MIC低至1μg/m L;化合物对MRSA的MIC值低至4μg/m L。化合物NCH16、NCH20、NCH28和NCH29对M.tb具有显着的抗菌活性,MIC≤0.25μg/m L,与乙酰甲喹相比活性提高了16～32倍。化合物NCH29在不同浓度下与M.tb感染的巨噬细胞孵育不同时间均表现出显着的胞内抗菌活性,在40×MIC浓度时与细胞孵育4 d后可以减少2.73-log数值的胞内M.tb;当不同浓度的NCH29与细胞孵育1 d后,胞内M.tb表现出0.1～1.69-log数值的降低。分析后发现,当喹恶啉环C2位乙酯或苄酯取代时,化合物抗菌活性较高;C3位引入-CF3后发现可以增加化合物的活性;C6位咪唑或1,2,4-三氮唑取代时,化合物抗菌活性较高;C7位引入氟原子显着增加化合物的活性,尤其当C6位引入官能团后,C7位须有氟原子取代才可以起到提升化合物抗菌活性的作用。3D-QSAR结果表明,在喹恶啉环C6位增加取代基的电负性,可以提高化合物的活性;C6位取代亲水性基团、C3位取代疏水性基团能够增加化合物的活性;在C2/C6位置的侧链基团,应该考虑具有更多氢键供体的基团。3.喹恶啉类化合物抗菌作用机制研究对大肠杆菌作用机制研究基于文献调研和前期研究结果,本课题对喹恶啉类化合物的作用机制做出假设:喹恶啉类化合物通过自身产生的ROS对细菌的DNA造成损伤;同时它还能干扰细菌对损伤的DNA修复的过程,从而进一步发挥抗菌作用。选取DNA合成与修复相关的酶,主要包括DNA聚合酶I、DNA连接酶和DNA拓扑异构酶（DNA回旋酶和DNA拓扑异构酶IV）等,通过对上述蛋白酶进行活性抑制试验阐明喹恶啉类化合物与DNA损伤修复系统之间的联系,结果表明:（1）喹恶啉类化合物对DNA连接酶和DNA拓扑异构酶无明显的抑制作用;（2）对DNA聚合酶I表现出显着的抑制活性,如喹多辛和替拉扎明在128μg/m L时对DNA聚合酶I的抑制率分别为80.2%和78.7%;（3）与底物d NTPs同时竞争酶的活性中心,并且能够抑制酶活性,且N-O键是化合物发挥作用的必要结构。上述结果可以初步确定喹恶啉类化合物通过抑制DNA聚合酶I的活性发挥作用。对结核杆菌作用机制研究首先测定了喹恶啉类化合物对M.tb能量稳态的影响,分别通过膜完整性试验、ATP消耗试验和RT-q PCR评估喹恶啉类化合物对M.tb能量稳态的影响。结果显示:NCH29处理M.tb后,细胞膜完整性受到破坏、菌体内ATP水平显着降低并且II型NADH脱氢酶（Type II NADH-dehydrogenase,NDH-2）相关m RNA（ndh和ndh A）的表达水平显着下调。上述结果表明,NCH29与M.tb作用后,造成细胞膜的损伤和破坏,使菌体无法维持稳态平衡以及自身生存;NCH29能够继续作用于ETC,干扰NDH-2功能的正常发挥,破坏菌体的氧化还原稳态,阻碍电子在ETC的正常传递,造成菌体内ATP水平显着下调,能量稳态受到破坏,导致M.tb的死亡。为研究喹恶啉类化合物作用于巨噬细胞后对M.tb的抗菌作用机制,本课题分别通过多功能酶标仪检测胞内ROS及线粒体超氧自由基的变化,自噬相关蛋白LC3 II的变化则由WB和共聚焦显微镜进行测定。结果表明,NCH29能够刺激M.tb感染的巨噬细胞内ROS水平的增加,并且ROS水平与化合物浓度和孵育时间呈正相关的关系;NCH29处理M.tb感染的细胞后可以诱导细胞自噬的发生,并且可以在胞内观察到大量自噬体标志物的堆积。上述结果表明,当NCH29作用于M.tb感染的巨噬细胞后,一方面可以刺激巨噬细胞产生大量的ROS,ROS进攻胞内的M.tb,起到杀菌作用;另一方面,高水平的ROS也可以诱导巨噬细胞自噬的发生,通过自噬这一生物过程清除胞内的M.tb,进一步发挥抗菌作用。综上所述,本课题设计合成了59个新型喹恶啉-N1,N4-二氧化物,并对其抗菌活性进行评价。采用3D-QSAR建立了新型喹恶啉-N1,N4-二氧化物抗菌活性的构效关系。本研究结果表明喹恶啉类化合物不仅可以通过ROS破坏细菌DNA双链,还可以抑制DNA聚合酶I的活性、干扰细菌能量稳态、诱导细胞自噬发挥抗菌作用。本课题深入研究了喹恶啉类化合物的抗菌作用机制并建立了构效关系,为进一步的喹恶啉类药物设计与改造提供了科学依据。
刘亦伦[3]（2021）在《壳聚糖/藻酸盐微凝胶包载双歧杆菌联合小分子PD-L1抑制剂对原位直肠癌的抗肿瘤研究》文中指出背景:随着癌症研究的不断深入和发展,免疫疗法,尤其是其中的免疫检查点抑制（Immune checkpoint blockade,ICB）疗法已经被证实在包括结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）在内的多种实体肿瘤的治疗中展现了显着的效果。然而,ICB疗法的有效性受到不同患者免疫应答的差异性和对肿瘤类型的敏感性的限制。因此,可以说真正可以从免疫疗法的治疗过程中获得益处的患者只是一小部分。然而随后的研究发现这种ICB疗法的限制性在某种程度上与人体内肠道细菌的数量与组分息息相关,即通过调控人体肠道内的菌群构成以及菌群数量可有望改善这种限制性。因此,肠道菌群与ICB疗法的联合应用受到了国内外广大学者的关注。传统的将细菌递送至体内的方式大致可以分为:静脉给药、灌注给药（肛门/尿道）、腹腔注射给药与口服给药等。相比于口服给药而言,注射的方式很可能会导致细菌进入血液,并随即造成如菌血症等一系列严重感染类疾病;而灌注给药的方式会降低患者的依从性。因此,口服给药可以说是目前患者依从性最高、方便性、安全性等最好的细菌递送方式。然而,由于胃的强酸性环境和肠道中胆汁盐的存在,直接将细菌经口腔递送会导致十分严重的细菌活性损失。因此,选择具有抗酸性,具有pH响应性释放特性的生物材料将这些细菌包封并制作成微胶囊是减少胃肠道通过期间细菌死亡并控制这些细菌在肠道中释放的有效的方法。目的:本研究选择双歧杆菌作为研究对象,为了更详细的了解这一细菌家族的特性与功能,从其亚种层面选择了长双歧杆菌、短双歧杆菌以及青春双歧杆菌分别进行研究。并制备了壳聚糖/藻酸盐微凝胶作为细菌载体用以递送双歧杆菌,从而在胃部保护细菌免受胃酸侵蚀,在到达结肠肠道后裂解并释放出包载的双歧杆菌。并且进一步将双歧杆菌微凝胶与小分子程序性细胞死亡配体1（Programmed cell death ligand 1,PD-L1）抑制剂联合应用,在Bal/bc小鼠原位直肠癌模型中从分泌物质以及免疫水平研究其抗肿瘤功效。我们分别从体外水平和动物体内水平对上述体系进行了探究。方法:在体外水平上,通过细菌菌液24 h MTT实验、菌液pH检测以及菌液短链脂肪酸（Short-chain fatty acid,SCFA）组分检测实验,对三种双歧杆菌菌液对肿瘤细胞抑制效果以及菌液性质、SCFA组分进行探究。微凝胶制备后,在体外水平上通过显微镜观察、共聚焦激光显微镜（confocal laser scanning microscope,CLSM）进行活死染色实验、扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope,SEM）观察以及初始微凝胶内细菌计数实验表征了微凝胶的外观及包载效率;随后通过微凝胶置于模拟胃液（Simulated gastric fluid,SGF）（37℃,2h）、模拟肠液（Simulated intestinal fluid,SIF）（37℃,直至破裂）体外模拟消化过程,并在这一过程中随时间推移检测细菌存活数和细菌释放数以绘制曲线,并计算微凝胶溶胀率与破裂率。在动物体内水平上,为了更加真实的模拟肿瘤生长环境,我们选择CT-26小鼠结肠癌细胞于Bal/bc小鼠直肠粘膜下构建原位直肠癌动物模型,于种瘤后14 d开始治疗,并记作D0。分别于D0,D5,D10,D15和D20采用小动物活体成像仪器观察小鼠体内肿瘤生长情况,同时于D0,D7及D14灌胃递送双歧杆菌微凝胶,对于联合治疗研究实验则在此基础上辅以腹腔注射的PD-L1小分子抑制剂,于D0,D4,D8,D12及D16给药。通过肿瘤解剖拍照、肿瘤称重、活体成像实验,对比治疗产生的肿瘤抑制效果。随即通过小鼠体重测量、肝功肾功检测验证治疗方案的生物安全性。而流式细胞术、肿瘤相关细胞因子以及分别SCFA检测则分别从免疫水平和分泌代谢水平分别检测了治疗所产生的抗肿瘤效果。此外,通过HE染色、Caspase-3、Ki67免疫荧光染色来探究肿瘤组织内部的坏死、增殖及凋亡状况。通过肿瘤组织PD-L1蛋白免疫荧光染色以及肿瘤远端、近端直肠粘膜双歧杆菌RNA Scope技术,我们对各实验组肿瘤内PD-L1含量进行了检测以研究双歧杆菌和PD-L1抑制剂的相互作用;同时,RNA Scope检测结果可以揭示肠道内双歧杆菌的分布情况,以研究双歧杆菌的聚集分布特征。结果:在体外水平上,我们通过对三种双歧杆菌菌液性质、成分的研究初步证实了三种双歧杆菌的菌液可以抑制CT-26小鼠结肠癌肿瘤细胞的生长,并证实了三种双歧杆菌的乙酸分泌功能。体外层面对制备的微凝胶相关表征证实了包载方案不会影响细菌的活性,可以高效对双歧杆菌进行包载。并且壳聚糖/藻酸盐微凝胶可以有效保护双歧杆菌免受胃酸的侵蚀,具有良好的包载性能以及高效的递送性能。相比于游离细菌在SGF中几乎全部死亡,微凝胶在体外模拟过程中可以在保护双歧杆菌18 h后完全破裂,以保证细菌安全的到达结肠部位,具有很好的细菌递送性能。而在体内动物模型上,相关实验证实了三种双歧杆菌单独使用可以抑制肿瘤的生长,而当其与PD-L1抑制剂联合使用时该效果会进一步加强。并且,我们证实了双歧杆菌微凝胶以及PD-L1小分子抑制剂均不会在体内产生明显的毒性,具有良好的生物安全性。而流式细胞术、肿瘤相关细胞因子以及粪便SCFA检测则分别从免疫水平和分泌代谢水平证实了治疗方案促进抗肿瘤免疫水平并且引起体内丁酸盐（抗肿瘤物质）的增多。随后通过HE染色、Caspase-3、Ki67免疫荧光染色证实了该治疗方案抑制肿瘤的增殖且促进肿瘤细胞内的坏死及凋亡。通过肿瘤组织PD-L1蛋白免疫荧光染色以及肿瘤远端、近端直肠粘膜双歧杆菌RNA Scope技术证实了双歧杆菌可以促进PD-L1的高表达进而提高PD-L1抑制剂的疗效,并且双歧杆菌在结肠内的分布具有一定程度的肿瘤周围聚集情况,具有一定的肿瘤靶向性。结论:1.我们通过表面涂层法制备的具有壳核结构的壳聚糖/藻酸盐微凝胶作为双歧杆菌的细菌微载体在制备途中可以保持绝大多数细菌的活性,并可以分别在SGF与SIF环境下对细菌起到明显的保护作用,在本研究中最多可以维持18h后方才完全破裂。该包载方案保证了细菌安全,高效的到达结肠部位,具有很好的细菌递送性能。2.从动物水平上,我们构建了小鼠原位直肠癌模型,研究双歧杆菌微凝胶单独使用或联合PD-L1小分子抑制剂的抗肿瘤效果。实验结果证实了每种双歧杆菌微凝胶均具备一定程度的抗肿瘤功效,以长双歧杆菌组尤为明显,并且与PD-L1抑制剂联合会进一步提高抗肿瘤效果。其抗肿瘤功效表现在免疫细胞水平变化、抗肿瘤相关细胞因子的增多以及细菌的抗肿瘤代谢产物。同时,其二者的联合应用存在内部关联并具备良好的生物安全性。3.体内相关实验证实了小分子PD-L1抑制剂的抗肿瘤效果,其功效与目前应用于实验或临床的单克隆抗体类免疫检查点阻滞剂（immune checkpoint inhibitors,ICIs）相近。而由于小分子 ICIs 具有价格低廉、吸收性好等优势可以更好的推广使用。而本研究的结果为目前较少使用的小分子类ICIs的功效做出了一定程度的证实。综上所述,三种双歧杆菌微凝胶单独或分别联合PD-L1小分子抑制剂用于原位直肠癌动物模型的治疗能够有效抑制肿瘤生长,并从分泌物层面以及免疫调控层面对肿瘤组织产生杀伤作用。可以明显抑制肿瘤增殖,促进肿瘤的凋亡,具有良好的生物安全性以及推广价值。同时,双歧杆菌微凝胶与PD-L1抑制剂还存在着内在关联,有着联合应用的理论基础,能够为肿瘤治疗提供新的思路。
林佳[4]（2021）在《高毒力肺炎克雷伯菌蛋白组学分析及其毒力标志物的鉴定研究》文中研究说明目的分析本院高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae,hvKP）的检出情况、耐药性、黏液表型、毒力基因型、荚膜血清型以及多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing,MLST）等,为本院hvKP感染的防控及精准诊疗提供依据;利用蛋白组学探索可区分hvKP与经典肺炎克雷伯菌（classic Klebsiella pneumoniae,c KP）的生物标志物;建立terE基因鉴别hvKP和c KP的方法学并对其性能进行评价,为临床微生物实验室鉴定hvKP的方法学选择提供参考。方法1.收集福建医科大学附属第一医院2019年3月至2019年8月临床分离的非重复411株肺炎克雷伯菌株,分别采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）和Vitek 2 Compact全自动药敏检测系统进行菌株鉴定和药敏分析;利用PCR扩增4种常见毒力基因（iuc A、iro B、rmp A、rmp A2）和6种荚膜基因（K1、K2、K5、K20、K54、K57）;通过拉丝试验检测肺炎克雷伯菌的黏液表型;应用MLST分析60株hvKP菌株之间的同源性;收集121株hvKP感染患者的临床资料对其进行回顾性分析。2.筛选6株hvKP,3株c KP以及1株700603肺炎克雷伯菌质控菌株进行label-free蛋白组学检测,同时进行GO和KEGG富集等生物信息学分析,寻找差异蛋白及其相关功能信息;对上述筛选出的Ter E蛋白采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）进行验证,并通过构建p ET28 a（+）-terE过表达质粒诱导纯化Ter E蛋白,应用MALDI-TOF MS对其进行检测获取Ter E蛋白质谱峰。3.针对蛋白质组学结果,采用PCR方法对Ter E蛋白的编码基因terE进行检测,并用临床分离的411株肺炎克雷伯菌对其和拉丝试验的诊断性能进行评价,采用卡方检验和Cohen’s Kappa对其进行统计学分析。结果1.以4个毒力基因（iuc A、iro B、rmp A、rmp A2）全部阳性为hvKP鉴定标准,在411株肺炎克雷伯菌中筛选出121株hvKP（29.4%）和290株c KP（70.6%）,毒力基因检出率分别为iuc A 39.2%（161/411）、iro B 38.7%（159/411）、rmp A 37.7%（155/411）、rmp A2 30.9%（127/411）。121株hvKP中有104株荚膜血清型检测阳性,其中K1、K2、K5、K20、K54以及K57的检出率分别为35.5%（43/121）,28.1%（34/121）,5.0%（6/121）,3.3%（4/121）,5.8%（7/121）,8.3%（10/121）,此外,有14.0%（17/121）hvKP的荚膜血清型未知。411株肺炎克雷伯菌中拉丝试验阳性率为32.4%（133/411）,其中,hvKP中的阳性率为77.7%（94/121）,c KP中的阳性率为13.4%（39/290）。MLST分型结果表明,60株hvKP菌株可分为ST23、ST65、ST268、ST592、ST36、ST1049、ST202、ST218、ST29、ST374、ST1265、ST1764、ST355、ST412、ST86、ST889共16型,其检出率分别为35.0%（21/60）,16.7%（10/60）,8.3%（5/60）,8.3%（5/60）,5.0%（3/60）,3.3%（2/60）,3.3%（2/60）,3.3%（2/60）,3.3%（2/60）,3.3%（2/60）,1.7%（1/60）,1.7%（1/60）,1.7%（1/60）,1.7%（1/60）,1.7%（1/60）以及1.7%（1/60）,其中ST23型主要以K1血清型为主。药敏结果显示,hvKP菌株对大多数临床常用抗菌药物敏感,其对哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、头孢替坦、头孢呋辛酯、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、左旋氧氟沙星和环丙沙星的耐药率均低于c KP（P<0.001）。2.蛋白组学分析结果显示,与c KP相比,hvKP中有59个差异表达的蛋白,其中表达上调的蛋白有21个,包括Ter E、Ter Z、Ter F以及外膜蛋白等;表达下调的蛋白有38个,包括DNA损伤诱导蛋白D、2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸酯脱氢酶、乙醇胺利用蛋白以及小热激蛋白等。hvKP和c KP差异表达蛋白质GO富集分析结果显示,差异蛋白主要与细胞组分,分子功能,生物过程有关;KEGG注释结果显示,差异蛋白主要参与果糖和甘露糖的代谢,氨基酸和核苷酸代谢,酮体的合成与降解等代谢途径。对筛选出的Ter E蛋白作为潜在生物标志物进行研究,Real-time PCR验证结果显示,hvKP和c KP组相比,terE m RNA的相对表达量显着增高（11293.93±11522.90 VS 0.80±0.67,P<0.0001）。通过p ET28a（+）-terE过表达质粒的构建和MALDI-TOF MS检测发现Ter E蛋白在11 k Da处存在相应的蛋白质谱峰。3.利用临床分离的411株肺炎克雷伯菌对拉丝试验以及terE基因检测法进行性能评价,发现拉丝试验鉴定hvKP的灵敏度为77.7%,特异度为86.6%,准确度为83.9%,阳性预测值为70.7%,阴性预测值为90.3%。对拉丝试验和参考方法进行一致性检验分析,其Kappa值为0.624,两者一致性一般。PCR检测分析发现411株肺炎克雷伯菌中terE基因的阳性率为35.0%（144/411）,其中hvKP中terE基因的携带率为95.9%（116/121）,c KP中terE基因的携带率为9.7%（28/290）。将terE基因检测作为判断高毒力肺炎克雷伯菌的指标,其灵敏度为95.9%,特异度为90.3%,准确度为92.0%,阳性预测值为80.6%,阴性预测值为98.1%。对terE基因检测法和参考方法进行一致性检验分析,其Kappa值为0.817,两种方法对hvKP的检测有较强的一致性。结论1.本院hvKP菌株的检出率为29.4%,其对大多数临床抗菌药物敏感性较高;临床分离的hvKP血清荚膜型主要为K1和K2血清型,ST分型主要以ST23型为主,其中ST23型hvKP以K1血清型为主。本研究揭示了我院hvKP的流行特点,为其溯源、防控以及临床诊疗奠定了理论基础。2.TerE蛋白有望成为hvKP鉴定的毒力标志物,利用MALDI-TOF MS检测TerE蛋白特异质谱峰,为KP检测和hvk P鉴别的同时完成提供了可能,但后续还需通过临床hvKP菌株进行性能验证;3.以临床分离的hvKP株对terE基因检测法进行性能评价,结果发现以其建立的方法学具有较高的灵敏度,特异度与准确度,可作为hvKP的鉴定方法。
李志涛[5]（2021）在《新型仿生胃肠道生物反应器研制与应用》文中研究表明胃肠道生物反应器是通过体外模拟人体胃肠道生理条件（如温度、动态p H、消化酶分泌、食物停留时间、流动混合和胃肠壁蠕动等）来研究食物消化的装备。可筛选大量物质,包括膳食成分、病原体,药物活性成分以及毒性或放射性化合物,评估它们如何改变胃肠环境,并且取样过程不受伦理约束。然而,与国外先进的设备相比,国内胃肠道反应器研制还处于起步阶段,难以达到模拟真实胃肠道消化过程的目标,限制了我国食品消化的跨学科研究。本文采用仿生学技术,模拟了胃肠道几何形态和内部结构,制备了仿生硅胶胃、小肠和大肠;利用内环境模拟技术,控制温度、p H、蠕动频率和内分泌等参数;通过发酵工程技术,建立了肠道微生物的高效率定植模型。在此基础上,集成肠道气体阵列传感器和智能控制系统,研制了仿生胃生物反应器、仿生小肠生物反应器和仿生大肠生物反应器。通过肠道微生物Akkermansiamuciniphila动态发酵培养、粪便体外定植培养、高抗性淀粉大米体外消化、抗性淀粉对粪便发酵影响和膳食脂肪酸对肠道气体分布影响等对反应器进行了逐步应用。本论文的主要研究成果如下:（1）仿生胃和小肠生物反应器研制及其体外消化研究研制了最多可以具有9个腔室的仿生胃和小肠组合生物反应器。在胃肠道几何形态方面,可分别模拟胃底、胃体、胃窦、十二指肠、空肠和回肠隔室反应器,隔室易于拆卸、方便灭菌,可独立或串联使用;在智能控制系统方面,开发了线下控制系统和线上云平台控制系统,可实现蠕动频率、分泌速率和p H等的检测和控制,历史数据导出和运行状态报警等功能;在模拟胃肠内部结构方面,分别制备了光滑型硅胶胃和硅胶小肠、褶皱型硅胶胃和绒毛型硅胶小肠,增大了肠道内的表面积,改变了食糜流变熵力,可促进食物破碎;在混合效果方面,反应器对牛顿流体和非牛顿流体都具有较好的混合效果,同等条件下优于传统釜式搅拌反应器;在胃内压方面,通过基本运动模式和强力运动模式控制,可实现胃的蠕动收缩阶段以及强力收缩阶段,收缩强度分别达到18-22 mm Hg、120-220 mm Hg;在破碎力方面,反应器最大破碎力大于0.72N,可以模拟固体食物在胃内的破碎功能;在p H控制方面,可根据食物的消化过程进行p H动态调节,还原了胃和小肠内酶活力动态调节;在排空速率方面,与已公开发布仔猪胃的排空相比,无显着性差异;在应用方面,将小麦粉、土豆粉、玉米粉、红薯粉、莲藕粉和大米粉在仿生胃和小肠反应器中模拟淀粉和蛋白质动态消化,在胃和小肠消化阶段均具有明显的差异。（2）仿生大肠生物反应器研制及其粪便定植研究研制了最多可以具有6个腔室的仿生大肠生物反应器,集成的线下控制系统和线上云平台智能控制系统,可有效控制反应器的发酵过程关键参数（蠕动频率、分泌速率、吸收速率、p H实时曲线等）。在大肠结构方面,制备了光滑型和褶皱型硅胶大肠;在混合效果方面,优于同等条件下的釜式搅拌反应器;在肠内压方面,模拟了低频和高频两种蠕动频率,肠内收缩强度分别达到60-90 mm Hg和100-150 mm Hg;在模拟吸收方面,可保持发酵液中短链脂肪酸在正常生理浓度内,使微生物生长不受抑制;在无菌验证方面,长时间运行后不易染菌,保证了实验的准确性;在p H控制方面,具有良好的酸碱平衡调节能力,维持大肠内环境,保证了微生物正常生长;在定植粪便微生物方面,微生物群落相似率大于85.17%,定植效果比较稳定。（3）仿生大肠生物反应器中Akkermansia muciniphila的生长和代谢研究基于研制的仿生大肠生物反应器,利用脑心浸出液肉汤（Brain heart infusion,BHI）培养基、猪粘蛋白（Porcine mucin,PM）培养基、人粘蛋白（Human mucin,PM）培养基、BHI+PM（BPM）培养基和BHI+HM（BHM）培养基对A.muciniphila进行体外动态发酵培养,并与传统静态培养对比。研究发现:在生物量方面,BHI动态培养的生物量为1.92 g·L-1,比静态培养提高了44.36%。利用HM动态培养,生物量进一步增加,达到2.89 g·L-1。在代谢产物方面,利用PM和HM动态培养,主要代谢产物为短链脂肪酸（乙酸和丁酸）,而其他3种培养基,则有相当数量的支链脂肪酸（异丁酸和异戊酸）产生。在外观形态方面,利用HM动态培养,细胞直径达999nm,外膜蛋白浓度最高,达到26.26μg·mg-1。结果表明,培养基营养成分和培养条件可直接影响仿生大肠培养A.muciniphila的生物量、外膜蛋白浓度和厚度以及细胞直径。（4）高抗性淀粉大米的不同加工方式对体外消化和肠道菌群影响研究以高抗性淀粉大米为原料,通过蒸煮、粉碎、发酵和高温高压处理,加工成米饭、米浆、米糕和爆米花,分别对其体外消化和粪便微生物发酵过程进行分析。研究发现:4种食物在胃和小肠反应器中淀粉消化率均符合一级两相方程,其中米糕中抗性淀粉含量最高（11.98%）。在仿生大肠发酵过程中,未消化米糕与菊粉相比,发酵速度较慢,丁酸浓度提高67.85%,促进短链脂肪酸合成的普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）和具有抗炎功能的粪杆菌属（Faecalibacterium）丰度增加,肠道微生物群失衡标志物变形杆菌门（Proteobacteria）和巨单胞菌属（Megamonas）丰度减少。结果表明,高抗性淀粉大米能调节肠道微生物群的发酵代谢产物和生态组成,有助于为糖尿病和肥胖患者的功能性食品设计提供参考。（5）膳食脂肪酸对肠道气体分布影响研究基于研制的仿生大肠生物反应器,通过肠道气体阵列传感器作为实时监测肠道气体为工具,配置基础培养基和膳食脂肪酸培养基作为营养基质,利用人体粪便微生物作为发酵菌株进行体外粪便发酵,分析基础营养和脂肪酸对肠道气体成分、浓度和体积影响变化,探讨膳食脂肪酸对肠道气体分布动力学。研究发现:粪便微生物利用膳食脂肪酸产生的气体成分主要为CO2、H2、H2S和VOC,其中CO2含量最高;可调控微生物发酵提高H2、H2S和VOC的浓度和体积。结果表明,膳食脂肪酸可刺激肠内H2S和VOC浓度升高,对高脂饮食造成肠道疾病的患病率增加提供一定参考,并可对降低肠内H2S和VOC浓度提供饮食指导。
李伟[6]（2021）在《膀胱癌相关泌尿系统菌群的特征解析、组织分布及差异细菌对膀胱癌细胞的作用研究》文中研究说明研究背景微生物组（microbiota）,又称菌群,是人体微环境的重要组成部分,主要分布在肠道、皮肤、口腔、呼吸道、生殖道等器官中。菌群与机体存在共生的关系,其变化可在一定程度上影响着人体生理、病理功能的改变。传统的观念一直认为“正常人的尿道与尿液是无菌的”,对泌尿系统细菌的认识主要停留在一些能引起泌尿系统感染的病原菌上。这种观念形成的主要原因是基于以常规细菌培养的方式来诊断尿路感染（urinary tract infections,UTIs）。然而,近年来随着高通量测序技术的发展及细菌培养方式的改进,已有多项研究证实正常人尿道中存在特定的微生物群落（菌群）,从而提出“泌尿系统菌群”这一崭新概念。进一步的研究发现,泌尿系统菌群的改变与急迫性尿失禁、膀胱过度活动症和前列腺癌等多种泌尿系统疾病密切相关。越来越多的证据表明,菌群在癌症的发生和发展中起着重要的作用,其中研究最为深入的是肠道菌群与结直肠癌的关系,具核梭杆菌导致结直肠癌发生发展的分子机制逐步被人们所认知。近年来,肿瘤自身菌群的研究也逐渐成为微生物组学领域研究的热点之一。2019年8月,Cell杂志发表的论文揭示了胰腺癌肿瘤菌群的多样性与患者存活率以及肠道菌群的关系（Cell,2019,178（4）:795-806）。2020年3月,美国加州大学Rob Knight团队通过分析TCGA数据库里的18116个样本,在包括膀胱癌在内的33种癌症组织中发现了一定的细菌序列,并认为检测组织和血液中的微生物可以作为癌症诊断的全新方法（Nature,2020,579（7800）:567-574）。2020 年 5 月,Science 杂志更是以封面文章的形式发表了关于肿瘤菌群的论文。该研究首次对肿瘤菌群进行了全面分析,研究了包括乳腺癌,肺癌,卵巢癌等在内的1526例肿瘤及癌旁组织,发现每种肿瘤都有其独特的菌群组成。肿瘤细菌大部分在细胞内,并且存在于癌细胞和免疫细胞中（Science,2020,368（6494）:973-980）。由于肿瘤自身菌群的含量相对较少和研究方法的局限性,比起肠道菌群,我们对肿瘤菌群分布及功能的了解还不够深入。然而,系统化的肿瘤菌群研究正在迅速改变我们对肿瘤以及菌群的认识,我们也正好有幸见证着一个重要领域的兴起与发展,以上研究为今后肿瘤菌群领域的研究提供了坚实基础以及新的方向。膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一,其发病率在我国男性泌尿生殖系统恶性肿瘤中占据第一位,且具有容易复发的特点,严重威胁人民群众生命健康。经研究证实,非洲曼氏血吸虫感染在膀胱鳞状细胞癌的发生发展中起了重要作用,这被认为是微生物与膀胱癌之间最早的联系。男性膀胱癌的发病率是女性的3～4倍,有多项研究证实尿液菌群的多样性在男女性别之间也存在显着的差异。卡介苗灌注是非肌层浸润性膀胱癌的标准一线治疗方法,可以有效减少膀胱癌术后复发,而卡介苗本身是牛分枝杆菌的减毒活菌体,它能够抑制肿瘤复发并不仅仅因为能激活人体免疫系统,也可能因为它作为外来优势菌株打破了原本有利于癌细胞发生发展的膀胱微生态环境。因此,我们推测膀胱癌患者的泌尿系统菌群可能存在独特的菌群组成和微生物群落结构的多样性,本研究将通过尿液和组织两个层面来研究膀胱癌患者的泌尿系统菌群,然后进一步探讨可培养的“差异细菌”对膀胱癌细胞生物学功能的影响。首先,本研究利用16S rDNA高通量测序研究膀胱癌患者尿液菌群和正常对照的组成特征及其多样性,同时采用尿液增强定量尿液培养（Enhanced quantitative urine culture,EQUC）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）来分析膀胱癌患者尿液与正常对照之间存在哪些可培养的“差异细菌”。为了进一步证实膀胱癌组织中菌群的存在,我们设计合成了细菌共有保守序列16S rDNA荧光探针,利用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）检测膀胱癌与癌旁组织中菌群的表达,并通过16S rDNA高通量测序来分析膀胱癌与癌旁组织中菌群的组成特征和多样性。通过分析膀胱癌患者与正常对照尿液16S rDNA测序数据和EQUC尿液培养结果,我们选择大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌（分别是革兰阳性菌、阴性菌和厌氧菌）等在膀胱癌患者与正常对照之间统计学差异最为显着的可培养细菌,分别与人膀胱移行细胞癌细胞T24、人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1构建共培养模型,分析上述三种差异细菌对膀胱癌细胞的增殖、迁徙、侵袭、细胞周期及细胞凋亡的影响。此外,本研究16S rDNA测序结果表明膀胱癌患者与正常对照尿液中存在很多种“不可培养细菌”（Uncultured Bacteria）,这些细菌在目前在常规培养条件下无法繁殖生长,即不可培养。我们在课题研究过程中也对利用MALDI-TOF MS直接鉴定尿液细菌的方法进行了探索,通过尿液的差速离心浓缩分离得到细菌蛋白,从而越过细菌培养这一阶段,试图经过质谱分析直接鉴定出膀胱癌患者与正常对照尿液中的不可培养细菌。同时,本研究将该方法转化应用到临床微生物检验的日常工作中,以期建立一种基于质谱技术的尿液细菌直接鉴定和快速药敏的整合方案。第一部分膀胱癌患者尿液增强定量培养质谱鉴定与尿液菌群特征分析目的:探寻膀胱癌患者与正常对照尿液菌群的组成特征和多样性差异,并通过EQUC增强定量培养和MALDI-TOF MS质谱鉴定以发现两组间的差异细菌。方法:利用术前插管导尿的方式收集膀胱癌患者的中段尿,并以骨科外伤患者为对照。采用EQUC增强定量尿液培养对膀胱癌患者组及对照组尿液样品进行培养,通过MALDI-TOF MS进行鉴定。经膜过滤技术后利用试剂盒提取尿液样本微生物组总DNA,采用16S rDNA V4区引物进行双末端测序;利用α多样性（Alpha Diversity）和β多样性（Beta Diversity）研究样本中的菌群物种组成和两组样本间的群落结构差异。结果:1.两组尿液样本均成功检测到细菌DNA序列,稀释曲线和Rank Abundance曲线显示测序效果良好,两种曲线在当前测序深度上基本趋于平稳,表明绝大多数的细菌种类已经被检测到。2.在门水平上,膀胱癌患者和正常对照组尿液中的菌群以厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门等为主。3.膀胱癌组的Observed species指数、ACE指数和Chao1指数平均值均大于对照组（P<0.05）,说明膀胱癌患者尿液菌群的丰富度要比对照组高。Simpson指数和Shannon指数均显示膀胱癌患者尿液菌群的多样性均大于对照组（P<0.05）。PCoA、PCA和NMDS分析结果显示,膀胱癌组和对照组各样本分别聚到一起,表明二者有不同的微生物群落,差异具有统计学意义。4.EQUC增强定量尿液培养和MALDI-TOF MS质谱分析结果显示:两组尿液共培养出腐生大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌、乳杆菌等21种细菌。经16S rDNA测序挖掘得到乳杆菌、棒状杆菌、大肠埃希菌等两组间的差异细菌,经EQUC方案可在膀胱癌患者及对照组尿液中培养分离出来。结论:1.通过EQUC尿液培养方案,膀胱癌患者和对照组尿液中培养出大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌,乳杆菌等多种细菌。2.尿液样本16S rDNA测序数据证实,膀胱癌患者和对照组尿液中均可以检测到菌群的存在,两组尿液样本中丰度最高的细菌物种为厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门。3.膀胱癌患者与对照组相比,其尿液菌群发生明显改变,有着不同的尿液菌群组成和群落特征,膀胱癌患者尿液菌群的丰富度和多样性均高于对照组。4.16S rDNA测序数据分析得到的两组间可培养的差异细菌,经EQUC方案可在膀胱癌患者及对照组尿液中培养分离出来,一致性较好,EQUC方案进一步拓展了尿液培养组学的方法。第二部分膀胱癌与癌旁组织菌群荧光原位杂交验证及组织菌群特征分析目的:在组织学层面进一步证实膀胱癌与癌旁组织中菌群的存在,研究膀胱癌与癌旁组织菌群的组成特征和多样性差异。方法:术中无菌采集膀胱癌患者癌组织及癌旁组织,设计16S rDNA（EBU338）荧光探针,利用FISH技术对膀胱癌和癌旁组织进行细菌荧光原位杂交,同时利用膀胱粘膜标志物Mucin-1和平滑肌标志物α-SMA进行免疫荧光实验,从而对膀胱组织中的细菌分布进行精准定位。利用试剂盒提取微生物组总DNA,采用16S rDNAV4区通用引物并基于Illumina NovaSeq测序平台进行双末端测序,对测序数据进行物种注释及丰度分析;利用α多样性和β多样性分析揭示样本中物种组成和样本间群落结构的差异。结果:1.FISH实验结果表明,膀胱癌组织及膀胱癌旁组织中均直接检测到细菌的存在,利用膀胱粘膜标志物Mucin-1的免疫荧光实验结果证实,在膀胱癌与膀胱癌旁组织的粘膜外层、粘膜层和粘膜下层均可观察到细菌,且细菌在粘膜外层分布最多。采用平滑肌标志物α-SMA的免疫荧光实验结果证实,不仅在粘膜层,在膀胱肌层检测到细菌的存在。2.膀胱癌与癌旁组织样本16S rDNA高通量测序结果显示,膀胱癌与癌旁组织样本中相对丰度最高的细菌物种为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和软壁菌门。在α多样性研究中,膀胱癌组的Observed species指数、ACE指数和Chao1指数平均值分别小于癌旁组织组,但经wilcox检验显示P值均>0.05,说明两组间菌群丰富度的差异没统计学意义;膀胱癌组Shannon和Simpson指数平均值均小于癌旁组织组,经wilcox检验显示P值均>0.05,说明两组间菌群α多样性的差异也没有统计学意义。3.在β多样性研究中,PCoA、PCA和NMDS分析的结果均标明,膀胱癌组与癌旁组织组的多数样本距在一起,说明两个组间的微生物群落组成结构的差异性很小,二者具有相似的微生物群落结构。基于Weighted Unifrac距离的Wilcoxon检验显示,膀胱癌组与癌旁组织组间差异的P值为0.072,没有统计学意义,说明膀胱癌组与癌旁组织组的β多样性差异不显着。4.LEfSe分析结果显示,膀胱癌组中具有统计学差异的物种在属水平为葡萄球菌属,而癌旁组织组中没有分析到具有统计学差异的物种。结论:1.膀胱癌组织和癌旁组织中均可以检测到细菌,与EQUC尿液培养的阳性结果相一致。细菌存在于膀胱癌与膀胱癌旁组织的粘膜外层、粘膜层、粘膜下层甚至平滑肌层,且细菌在粘膜外层分布最多。2.膀胱癌与癌旁组织样本中相对丰度最高的细菌物种为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和软壁菌门,与膀胱癌患者尿液菌群的组成结果相一致。3.与癌旁组织相比,膀胱癌组织菌群存在较低的物种丰富度和多样性,但这些差异没有统计学意义;膀胱癌组织与癌旁组织有着相似的菌群群落结构。4.在属水平上,膀胱癌组中具有统计学差异的物种为葡萄球菌属。第三部分差异细菌对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期、凋亡的影响目的:利用第一部分和第二部分筛选出的大肠埃希菌、脆弱拟杆菌和腐生葡萄球菌等可培养的差异细菌,与膀胱癌细胞和人永生化膀胱上皮细胞进行共培养,探究其对两种细胞的增殖、迁移、侵袭能力及凋亡的影响。方法:取T24细胞、SV-HUC-1细胞分别与腐生葡萄球菌、大肠埃希菌、脆弱拟杆菌进行共培养,采用CCK8实验、划痕实验、Transwell实验及Annexin V-FITC/PI双标流式细胞学实验检测两种细菌对T24细胞、SV-HUC-1细胞的增殖、迁移、侵袭能力及细胞周期、细胞凋亡的影响。结果:1.在MOI=500接种密度下,大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌对T24细胞和SV-HUC-1细胞的影响较大,细胞数目明显减少,细胞形态发生变化,贴壁生长的细胞数量减少,当MOI=100时,三种差异细菌分布与T24细胞核SV-HUC-1细胞共培养,细胞形态没有发生明显变化,仍能贴壁生长。2.在MOI=100条件下,相比于空白对照组,大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌均对T24细胞增殖产生抑制作用;对于SV-HUC-1细胞,大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌对其增殖不产生影响。3.在MOI=100条件下,相比于空白对照组,T24细胞与大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌共培养24小时,细胞迁移率明显降低,且差异有统计学意义。SV-HUC-1细胞分别与大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌分别共培养24小时后,细胞迁移率与空白对照组相比均无明显差异。4.在MOI=100条件下,相比于空白对照组,三种差异细菌与T24细胞孵育后,Transwell下室中细胞数目减少,差异具有统计学意义。5.在MOI=100条件下,与空白对照组相比,大肠埃希菌与T24细胞孵育24小时,造成T24细胞的G1期延长,S期缩短。腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌与T24细胞培养后对细胞周期的影响较小。三种差异细胞与SV-HUC-1细胞共培养后对细胞周期影响较小,差异无统计学意义。三种细菌与T24细胞共培养后,T24细胞的凋亡率与正常对照组相比,差异无统计学意义。三种差异细胞与SV-HUC-1细胞共培养对细胞凋亡率的影响较小,差异无统计学意义。结论:1.利用课题前期筛选出的大肠埃希菌、脆弱拟杆菌和腐生葡萄球菌等可培养的差异细菌,与T24膀胱癌细胞和SV-HUC-1人永生化膀胱上皮细胞进行共培养,当MOI=100时,两种细胞形态未发生明显变化,细胞仍在贴壁生长,成功构建三种差异细菌与两种细胞的共培养模型。2.大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌对T24细胞的增殖、迁移和侵袭具有抑制作用,大肠埃希菌可抑制T24细胞分裂。对SV-HUC-1细胞,大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌对其增殖和迁移不产生影响。三种差异细菌对T24和SV-HUC-1细胞的凋亡不产生影响。3.我们推测膀胱癌相关差异细菌对膀胱癌细胞生物学功能的抑制作用可能与膀胱癌微生态环境里的人体宿主反应有关,人体可能通过一系列的免疫杀伤反应筛选出对膀胱癌发生发展具有抑制作用的共生菌,使其在膀胱及尿液中的丰度升高,从而起到抑制膀胱癌细胞的作用。第四部分膀胱癌尿液不可培养细菌的质谱直接鉴定及拓展应用研究目的:利用MALDI-TOF MS技术对膀胱癌患者尿液中不可培养细菌进行直接鉴定,探讨该方法的可行性,并将该方法拓展应用于尿路感染患者尿液细菌的直接鉴定和快速药敏。方法:1.建立差速离心直接浓缩分离病原菌的方法,将膀胱癌患者尿液进行差速离心,分离浓缩病原菌,评估所建立方法的分离效果。2.将所分离浓缩的膀胱癌患者细菌沉淀物进行MALDI-TOF MS直接鉴定。3.利用尿液流式UF-1000i技术筛查尿路感染患者,确定尿液病原菌浓度的cut-off 值。4.将所分离浓缩的病原菌沉淀物进行MALDI-TOF MS直接鉴定和VITEK2快速药敏,评估直接鉴定和快速药敏与常规尿液培养方法的符合率,及该方法的周转时间（Turn-around Time,TAT）。结果:1.所建立的差速离心方法对革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌都取得较好的分离浓缩效果,细胞及其碎片被有效去除。2.MALDI-TOF MS对膀胱癌与正常对照浓缩分离后的细菌沉淀物可获得部分蛋白峰,但基于现有的细菌质谱数据库,不能够得到有效分析,未能直接鉴定出不可培养细菌。3.通过对1638个尿液样本进行UF-1000i筛选,确定尿液病原菌浓度cut-off值为≥5000细菌/μl。在1638个尿液样本中,病原菌浓度≥5000细菌/μl的尿液样本有307个,其中265个（86.32%）为单菌生长,适合下一步进行MS直接鉴定,16个为双菌生长,22个培养为污染,4个培养阴性;<5000细菌/μl的尿液样本有1331个,其中98个单菌生长,6个双菌生长,即总体漏检率为 6.35%（104/1638）。4.利用本MALDI-TOF MS直接鉴定方法对184例革兰阴性杆菌感染的尿液样本进行了直接鉴定,有163例（88.59%）的质谱鉴定得分高于2,17例（9.24%）的得分为1.7-2,而得分低于1.7仅有4例（2.17%）。在163例鉴定到种的革兰氏阴性杆菌中,大肠埃希菌的鉴定符合率为98.01%（99/101）,肺炎克雷伯菌为97.22%（35/36）,其余例如变形杆菌、铜绿假单胞菌等符合率均为100%。在15个葡萄球菌感染尿液样本中,有14个（93.33%）获得了可靠直接鉴定,而在51个肠球菌属样本中,只有32个（62.75%）被可靠鉴定。在9个念珠菌样品中,仅2个在属水平上被直接鉴定,效果较差。5.对72例肠杆菌目尿液样本一共做了 1296项药敏测试,两种方法之间的整体类别一致率为94.83%（11229/1296）,小错误率为4.17%（54/1296）,大错误率为0.92%（12/1296）,极大错误率为0.08%（1/1296）。在18例革兰氏阴性非发酵菌的样品中,共进行了 378次药敏测试,整体类别一致率为94.44%（357/378）,小错误率为 2.91%（11/378）,大错误率为 1.59%（6/378）,极大错误率为1.06%（4/378）。在10例葡萄球菌的样品中共进行了 160次药敏测试,总体类别一致率为94.38%（151/160）,小错误率为3.12%（5/160）,大错误率为 1.87%（3/160）,极大错误率为 0.63%（1/160）。6.利用所建立的尿液流式-质谱-VITEK方法进行直接鉴定和快速药敏的TAT时间缩短至6-24h。结论:1.所建立差速离心法可以浓缩分离尿液细菌,对膀胱癌与正常对照尿液细菌沉淀物进行质谱分析可获得蛋白峰,但基于现有细菌质谱数据库的鉴定效果较差,未能直接鉴定出不可培养细菌。2.该方法能够用于尿路感染患者细菌的质谱直接鉴定和VITEK系统快速药敏,整体一致率较高。3.所建立的尿液流式-质谱-VITEK方法对革兰阴性杆菌直接鉴定和快速药敏的TAT时间缩短至6-24h。
林萍[7]（2021）在《基于“中药多糖-产丁酸菌”研究健脾方参苓白术散的微生态机制》文中提出目的:参苓白术散作为常用方剂,在临床上治疗脾虚湿盛型泄泻效果显着,运用广泛,实验研究表明这些中药复方能够调节肠道菌群,达到治疗泄泻的目的。但是对参苓白术散复方的何种成分起到调节肠道菌群作用的研究很少。而多糖作为中药的主要成分之一,在发酵过程中可作为特定肠道菌群的独特碳源,可能是调节肠道菌群的作用成分。产丁酸菌作为一类功能菌群,其代谢产物丁酸已被证明对泄泻具有治疗作用。目前,对于“中药多糖-产丁酸菌”的研究较少,亟待加强。基于以上背景,本研究以热激法、气相色谱分析、16S r RNA基因基因测序、第二代测序、第三代测序、以参苓白术散为唯一碳源进行体外碳源实验等技术,围绕“中药多糖-产丁酸菌”进行研究,旨在通过动物实验与体外碳源实验联合,研究参苓白术散中药与其多糖成分调节肠道产丁酸菌的微生态机制。方法:（1）通过水浴热激筛选芽孢菌,再通过涂布、划线进行分离,并通过产酸实验、革兰氏染色、气相色谱分析、16S r RNA基因等生理实验与分子分析方法进行产丁酸菌鉴定,为后续实验提供模式菌材料。（2）通过二代和三代即Illumina与Pac Bio的测序方式对分离的产丁酸菌进行全基因组测序,并对基因组信息进行概述,包括基因组大小、t RNA、r RNA、CDS数目等进行分析。利用Glimmer（http://ccb.jhu.edu/software/glimmer/index.s htm L）,Gene Mark S,Prodigal软件对基因组中的编码序列（CDS）进行预测。通过预测得到分离菌功能基因的核酸序列和氨基酸序列,用于后续功能和系统进化分析。扫描图组装结果默认使用Glimmer进行预测,完成图组装结果默认使用G limmer预测染色体基因组,使用Gene Mark S预测质粒基因组。通过全基因组分析了解该菌RAZ1的基因特点。（3）通过抗生素、艰难梭菌灌胃诱导肠道菌群失调模式构建AAD（Antibiotic-associated diarrhea,抗生素相关性腹泻）大鼠模型,造模后大鼠出现食少、粪便不成形、反应灵敏度降低等症状。使用参苓白术散汤剂进行治疗,治疗后AAD大鼠逐渐恢复饮食、粪便成形、灵敏度提高。采集各阶段大鼠粪便并提取DNA,使用丁酰辅酶A-辅酶A转移酶基因引物BCo Atscr F和BCo ATcr R对粪便DNA基因进行PCR扩增后,再采用TA cloning测序平台检测大鼠在正常阶段、AAD模型阶段和治疗阶段肠道产丁酸菌的多样性与菌群结构的变化,研究基于参苓白术散复方对肠道产丁酸菌的影响结果。（4）通过以参苓白术散多糖为唯一碳源构建多糖培养基（Polysaccharide Medium,PM）,连续取样法,测定产丁酸菌在PM、及PM降解液（分别经脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、厚壁菌YT2）中的生长曲线和丁酸浓度曲线,进一步研究参苓白术散中药多糖成分对产丁酸菌的生长与产丁酸浓度的影响,完成参苓白术散多糖成分是否能调节肠道产丁酸菌的体外研究。结果:（1）在健康成人粪便中分离出一株产丁酸菌RAZ1,菌落形态呈光滑的乳白色圆形凸起,革兰氏染色阳性。气相色谱分析结果表明RAZ1具有产丁酸能力。16S r RNA基因进化树结果显示,RAZ1菌属于梭状芽孢杆菌。（2）菌株RAZ1样本的染色体基因组数量为1,不含基因组的质粒基因,基因组大小为4056467 bp,基因数量为3902个,基因总长度为3427287 bp基因组GC含量为28.05%,测序深度为378.42。t RNA数量有85个,r RNA数量为30个。NR数据库比对结果为共3899个编码蛋白;Swiss-Prot数据库比对结果为共得到2592个注释蛋白;Pfam数据库比对结果为共得到3039个注释蛋白;COG数据库比对结果为共得到3196个注释蛋白;GO数据库比对结果为共得到2783个注释蛋白;KEGG数据库比对结果为共得到1811个注释蛋白。（3）参苓白术散治疗AAD大鼠实验中,AAD大鼠粪便产丁酸菌多样性结果为:正常喂养阶段以Roseburia属为主,还有Clostridium、Eubacterium、Lacrimispora、Psychrosphaera、Agathobacter、Geobacillus、Oscillibacter属,共8个属;建模阶段,减少到只有3种属,以Clostridium属最多,其次是Roseburia和Anaerofustis属;治疗阶段,属的种类逐渐恢复到7种,以Eubacterium属最多,Clostridium属和Roseburia属次之,还有Lacrimispora、Hydrogeniiclostidium和Bacteroides属。系统发育树显示,所有样本序列可归属于16个Cluster,基于16S分析,产丁酸菌在系统分类结构上主要优势菌群存在于厚壁菌门（Firmicutes）中,也有部分产丁酸菌分布在拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）。将参苓白术散汤剂治疗AAD大鼠各阶段的簇进行百分比分析可知:SPD1,产丁酸菌分布最广,分布于11个Cluster中;SPD2产丁酸菌多样性显着降低,只分布在5个Cluster中,其中Cluster11占主要部分;SPD3产丁酸菌分布在7个Cluster中,与SPD1相比,多样性降低,但与SPD2相比,多样性回升,产丁酸菌结构也发生改变,Cluster11比例降低,Cluster4所占比例明显增加。（4）产丁酸菌与多糖降解菌的组合在参苓白术散多糖培养基中最大生长结果比较显示:产丁酸菌与多形拟杆菌组合最大生长结果优于产丁酸菌与厚壁菌YT2组合优于产丁酸菌与脆弱拟杆菌组合优于产丁酸菌独自培养,最大生长结果分别为:（0.959±0.09）×109CFU/m L、（0.929±0.09）×109CFU/m L、（0.686±0.09）×109CFU/m L、（0.129±0.09）×109CFU/m L。产丁酸菌与多糖降解菌的组合在参苓白术散多糖培养基中的最高产丁酸浓度结果分别为:3540.67 mg/L、3614.67mg/L、2725 mg/L、342 mg/L。与对照组BHI复合碳源相比,产丁酸菌与多糖降解菌的组合中,最大生长结果比较为:产丁酸菌独自培养优于产丁酸菌与多形拟杆菌组合优于产丁酸菌与厚壁菌YT2组合优于产丁酸菌与脆弱拟杆菌组合。最大生长结果分别为:（0.916±0.09）×109CFU/m L、（0.474±0.09）×109CFU/m L、（0.263±0.09）×109CFU/m L、（0.220±0.09）×109CFU/m L,产丁酸浓度分别为:2835.67 mg/L、1625 mg/L、1126.67 mg/L、1147.5 mg/L。产丁酸菌在经多糖降解菌降解的参苓白术散PM降解液中最大生长结果皆大于在经多糖降解菌降解的BHI降解液。结论:根据生理实验与分子实验结果显示,实验成功从健康成人粪便中分离出一株菌RAZ1,具有产丁酸功能,符合对产丁酸菌的定义。全基因组结果表明该菌基因组大小为4056467 bp,基因数量为3902个,基因总长度为3427287 bp基因组GC含量为28.05%,测序深度为378.42。t RNA数量有85个,r RNA数量为30个。RAZ1菌存在大量碳水化合物活性酶,主要包括糖苷水解酶、糖基转移酶、碳水化合物酯酶和辅助活动的酶,其中包含RAZ1菌的产丁酸途径,从基因组角度剖析产丁酸菌生产丁酸的生产代谢途径。实验选择一株购买的丁酸梭菌进行与实验室分离的产丁酸菌进行对照,进行后续体外碳源实验。实验表明参苓白术散具有调节AAD模型大鼠肠道产丁酸菌多样性的功能,能够恢复被抗生素破坏肠道产丁酸菌多样性。根据以参苓白术散多糖为唯一碳源的体外实验,结果提示,参苓白术散调节肠道产丁酸菌菌群的机制可能是参苓白术散多糖成分被肠道多糖降解菌先降解为单糖/丙酮酸,再由产丁酸菌将单糖/丙酮酸分解代谢成丁酸,调节肠道菌群与肠道丁酸浓度,达到治疗效果。但参苓白术散多糖对不同多糖降解菌与产丁酸菌的组合的生长与丁酸浓度调节效果存在差异,不同碳源对不同多糖降解菌与产丁酸的组合影响也有差别,这可能是引起不同中药复方治疗作用不同的原因,亟待后续深入研究。
陈其文[8]（2021）在《功能材料增强细菌生物活性用于疾病治疗的研究》文中提出微生物如某些细菌、病毒、真菌、微藻等具有天然疾病治疗活性、病灶靶向性、基因可编辑性、易修饰性等优点,在生物医药领域受到了广泛关注。利用这些优点,微生物正被开发成用于疾病治疗的新一代活性生物材料。但微生物在体内易被免疫清除、有潜在毒性、治疗效果受限,这些问题亟需解决。随着材料科学的快速发展,功能材料被引入与微生物有机地结合构建以微生物为基础的生物杂化系统,有效地解决了微生物疾病治疗中的各种问题。为了进一步开发微生物的疾病治疗潜力,本文构建了一系列功能材料增强细菌生物活性的生物杂化系统。这些构建的生物杂化系统利用合适的功能材料与细菌杂化整合,增强了细菌的生物活性,提高了其疾病治疗能力。第一章中,首先介绍了各种微生物在疾病治疗中的应用,接着介绍了功能材料修饰的微生物在疾病治疗中的优势及目前的发展,最后展望了该领域未来的发展方向。第二章中,利用细菌自矿化光热剂生物活性合成了具有优异光热效应的光热细菌,再通过修饰具有线粒体靶向的金属有机框架材料（MOFs）在光热细菌表面构建了可增强肿瘤光热治疗效率的生物杂化系统。该系统中,细菌自矿化钯纳米粒子光热剂在其表面合成光热细菌,并保持细菌活性。封装了光敏剂亚甲基蓝（MB）的MOFs通过酸敏感的亚胺键进一步修饰在细菌表面,可利用细菌肿瘤厌氧靶向进入肿瘤微环境。在微酸性肿瘤微环境中,修饰的MOFs脱离细菌表面并选择性地在肿瘤细胞线粒体中被ATP降解释放封装的MB。在光照下,释放的MB产生单线态氧造成线粒体功能紊乱,降低线粒体ATP的合成,抑制细胞内热休克蛋白（HSPs）的表达,最终增强光热细菌的光热治疗效果。第三章中,利用细菌的特殊呼吸代谢生物活性构建了二氧化锰纳米花修饰具有电化学活性细菌的生物杂化系统。在该系统中,细菌以肿瘤代谢产生的乳酸作为碳源,以修饰在细菌表面的二氧化锰纳米花作为电子受体,进行呼吸代谢作用,消耗肿瘤微环境中过量的乳酸。此外,二氧化锰纳米花也能催化肿瘤内高浓度的过氧化氢为氧气,下调低氧诱导因子-α（HIF-α）的表达,进一步降低肿瘤细胞乳酸的产生。乳酸对肿瘤的发生发展及肿瘤内的免疫抑制具有促进作用。该系统从抑制乳酸产生及消耗微环境乳酸浓度两个方面降低了肿瘤内的乳酸水平,实现了显着抑制肿瘤生长的效果。第四章中,利用细菌孢子萌发耗氧的生物活性特点构建了益生元-益生菌孢子微球系统。在该系统中,经魔芋葡甘露聚糖改性合成的功能化糖微球可在结肠炎症部位长时间滞留,促进肠道有益微生物的生长。封装的细菌孢子到达结肠炎症部位后萌发,消耗炎性肠道中氧气,结合芽孢上修饰的姜黄素的抗炎抗氧化作用,构建的益生元-益生菌孢子微球可选择性抑制致病性肠杆菌科的生长爆发,减少肠道炎性因子,调节肠道菌群,实现对结肠炎的良好治疗。
李梦辉[9]（2020）在《基于静态顶空分析技术评价天然产物活性新方法的研究》文中研究说明随着微生物感染和癌症所造成的人类疾病逐年增加,严重威胁着人类健康和生活质量,给当代的医学研究带来了巨大挑战。源自植物、动物及微生物提取物的天然产物资源丰富,化学结构复杂多样,生物相容性高,多年来是新药或先导化合物研发的重要来源。天然产物丰富的骨架结构是在生长过程中生物与环境长期相互作用产生生态防御系统时形成的,因此,从天然产物中获得的新药线索通常质量更好,更加生物友好。抗细菌药敏试验和药物体外抗肿瘤活性的测定是药物筛选及后续新药开发活性评价的基本手段,也是流行病学研究及临床药物使用的重要依据。在进行天然产物活性筛选时,一些药用生物提取物,尤其是植物粗提物,其成分比较复杂,含有多种色素和不溶性成分。基于传统的计数或光学方法均存在一定程度的干扰和不确定性,无法满足药物活性准确评价及不同实验室间结果比较的需求。据此,基于现代分析检测手段,开发针对药物活性评价的新方法十分必要。根据微生物的代谢特性,确定与其生长相关的代谢物被认为是监测微生物行为的一种间接方法,该方法已被广泛用作研究微生物的生物标志物。在这些研究中,二氧化碳（CO2）是微生物代谢产物中主要挥发性物质之一,即,可通过检测微生物代谢过程中释放的CO2量来反映微生物细胞活性或繁殖能力。相比于传统抑菌圈法、平板计数法以及浊度法,基于现代分析仪器的顶空气相色谱法检测灵敏度高、线性范围宽,能够检测微生物代谢产生的低浓度二氧化碳,从而快速确定其活性。在天然产物筛选药物的领域中,尚未建立利用气相色谱法进行药物筛选的方法,因此建立利用气相色谱法测定药物尤其是天然药物的抑菌活性和细胞增殖活性具有重要的现实意义。1.建立了一种可通过测量在药物-细菌培养系统中代谢产生的二氧化碳的量来确定天然产物中药物化合物或粗提取物的抗菌活性的新方法。将2 mL含有细菌和目标药物的培养基在37℃下培养24小时,使用顶空气相色谱仪（HS-GC）结合热导检测器（TCD）测量顶空瓶中细菌代谢产生的二氧化碳量,以评估药物的抗菌活性和最小抑菌浓度,建立并验证了本方法的原理和标准程序。结果表明,本方法的精密度小于4%（以相对标准偏差表示）,且在抑制率（R2=0.935）和半抑制浓度（R2=0.994）上与参考方法（光密度法）具有很好的一致性。由于在封闭系统中进行原位培养和检测,本方法在微生物检测方面比传统方法更简单、安全,并且适用于大多数天然产物抗菌活性的常规分析,在细菌菌株和样品性质适用性方面都具有高灵活性。2.建立了一种利用实验室常规装置在常压下有效除氧的方法,可以根据实验满足不同含氧量的要求。通过研究厌氧瓶容积,通气时间和氧气去除率之间的关系,建立了基于气体置换动力学的厌氧瓶除氧的数学模型,并对该方法进行验证。结果表明,预测结果与实测结果吻合较好（R2=0.98）,说明该方法可作为厌氧环境下氧去除的可靠工具,并能提供最终除氧浓度或氧气去除率的近似值。简而言之,该方法能快速达到常规实验室所能达到的除氧目的,操作简便。在除氧过程中,压力和温度不发生变化,为后续厌氧实验的开展提供了可靠的保证。3.建立了一种利用顶空-气相色谱法（HS-GC-TCD）测定候选药物抗厌氧活性的新方法。厌氧菌在厌氧环境下接种或快速使用无菌注射器密闭接种,在加药和不加药处理后培养48h,以培养基中的代谢酸度作为细胞活动的指标,用碳酸氢钠将代谢酸完全转化为CO2后,用HS-GC-TCD测定其含量。本方法精密度高（相对标准偏差低于5%）,同时通过与抗生素和植物提取物的抑制率（均方根误差=10%）和半数抑制浓（R2=0.996）与参考方法进行了验证。本方法对细胞活性反应灵敏,可减少交叉污染,适合于抗厌氧活性的多种药物的常规筛选。4.建立并验证了利用顶空气相色谱法测定细胞增殖活性的新方法。将细胞在顶空瓶中培养,然后通过气相色谱法测定细胞代谢产生的CO2的量来反映细胞的个数,并对该方法进行了准确性和精密度（相对标准偏差低于5%）的验证。通过与传统的SRB法检测96孔板培养细胞数量比较,HepG2细胞能在顶空瓶中生长良好（R2=0.933）。通过与SRB检测法进行对比证明了本方法在细胞增殖活性中的可靠性（R2=0.948）。与传统的孔板培养进行染色法相比,本方法避免了测定过程中人为操作因素带来的误差,减少细胞培养中样品交叉污染的问题,并且测定速度快节省时间。
胡洁[10]（2019）在《基于MALDI-TOF MS对血流感染病原菌的快速鉴定及药敏试验研究》文中指出基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）是一种快速准确检测细菌的有效手段。目前临床微生物室使用的MALDI-TOF MS主要是进口的仪器,虽然近年来国产质谱仪迅速发展,但仅仅停留在对细菌单菌落的鉴定,尚无直接检测临床样本的相关数据。而血流感染,尤其是多重耐药菌株的感染是临床最严重的感染之一,发病率和致死率高,因此对血培养阳性样本病原菌以及对耐药菌的直接、快速和准确检测是临床有效诊断和治疗的关键。本次研究分为两部分内容:第一部分采用改良检测方法评估国产质谱仪（毅新博创Clin-TOF-ⅡMS）对血培养阳性标本中病原菌快速鉴定的能力,为国产质谱进入临床微生物实验室提供数据支持;第二部分采用德国布鲁克质谱仪（Microflex LT Bruker MS）直接检测血培养阳性标本耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌,旨在缩短临床报告耐药菌时间,降低临床治疗费用,为临床有效合理的治疗提供帮助。第一部分:采用改良检测方法评估国产质谱仪Clin-TOF-ⅡMS对血培养阳性标本中病原菌快速鉴定的能力。收集临床666瓶阳性血培养瓶,包括美国BD公司的97瓶树脂需氧瓶（BACTEC’s Plus Aerobic/F,PAF）、121瓶树脂厌氧瓶（BACTEC’s Lytic Anaerobic/F,LAF）,法国梅里埃生物公司的161瓶中和抗生素成人需氧培养瓶（BacT/Alert FAN Aerobic,FA）、197瓶成人厌氧培养瓶（BacT/Alert FAN Anaerobic Plus,FN）、90瓶成人需氧培养瓶（Standard Aerobic,SA）,前处理后采用Clin-TOF-ⅡMS进行鉴定,以Bruker MS对传统纯培养的鉴定结果作为参考。结果表明,Clin-TOF-ⅡMS对血培养阳性标本的鉴定准确率高达88.6%（590/666）。第二部分:采用Bruker MS直接检测血培养阳性标本中耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌。选取50株已知碳青霉烯耐药基因背景清晰的肺炎克雷伯菌和1株肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC700603作为建库用模拟菌株,采用快速水解法确定美罗培南的完整峰和水解峰,以获得区分产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的特征峰。收集临床106份血培养阳性标本进行快速鉴定,鉴定为肠杆菌科细菌样本采用水解法进行药物敏感性试验。结果显示,106份血培养样本中105份鉴定成功,鉴定失败的1份样本为混合菌感染样本。105份鉴定成功样本中94份鉴定为肠杆菌科细菌,用Bruker MS进行美罗培南水解法药敏试验,检测为碳青霉烯类耐药的准确度达到92.6%（87/94）,具有84.2%（32/38）的灵敏度和100%的特异性（55/55）。我们的研究显示采用本课题组改良方法对国产质谱仪在血培养样本的快速鉴定上具有非常好的优势,同时,对血培养样本快速鉴定和耐碳青霉烯肠杆菌科细菌的直接检测也提供了一种有效的方法,缩短了报告时间,有助于临床医生针对性的治疗,为抗生素的合理使用提供有效的保障。
二、细菌自动培养仪厌氧培养的临床应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细菌自动培养仪厌氧培养的临床应用（论文提纲范文）
（2）具有抗菌活性的新型喹恶啉-N1, N4-二氧化物的设计、合成和作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 1 前言 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.2 研究进展 |
| 1.2.1 喹恶啉类化合物生物活性研究进展 |
| 1.2.2 喹恶啉类化合物构效关系研究进展 |
| 1.2.3 喹恶啉类化合物抗菌作用机制研究进展 |
| 1.2.4 细胞自噬和ROS发挥抗结核杆菌活性的研究进展 |
| 1.3 研究内容和目标 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.2 研究目标 |
| 2 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的设计、合成与活性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌种与细胞 |
| 2.1.2 药物与试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.1.5 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的合成 |
| 2.1.6 细菌培养 |
| 2.1.7 抗菌活性的测定(MIC) |
| 2.1.8 抗真菌活性的测定 |
| 2.1.9 细胞培养 |
| 2.1.10 细胞毒性 |
| 2.1.11 抗结核杆菌活性的测定 |
| 2.1.12 3D-QSAR |
| 2.1.13 化合物理化性质预测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物(TZN1~26)的结构表征 |
| 2.2.2 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物(TZN1~26)理化性质 |
| 2.2.3 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物(TZN1~26)抗菌活性 |
| 2.2.4 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物细胞毒性结果 |
| 2.2.5 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物3D-QSAR研究 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的设计与合成 |
| 2.3.2 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物抗菌活性的分析 |
| 2.3.3 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物构效关系分析 |
| 2.3.4 新型噻唑烷酮-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的细胞毒性 |
| 2.4 小结 |
| 3 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的设计、合成与活性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌种与细胞 |
| 3.1.2 药物与试剂 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.1.5 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的合成 |
| 3.1.6 细菌培养 |
| 3.1.7 抗菌活性的测定(MIC) |
| 3.1.8 细胞培养 |
| 3.1.9 细胞毒性 |
| 3.1.10 抗结核杆菌活性的测定 |
| 3.1.11 3D-QSAR |
| 3.1.12 化合物理化性质预测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物(NCH1~33)的结构表征 |
| 3.2.2 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物(NCH1~33)理化性质 |
| 3.2.3 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物(NCH1~33)抗菌活性 |
| 3.2.4 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物细胞毒性结果 |
| 3.2.5 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物3D-QSAR研究 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的设计与合成 |
| 3.3.2 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物抗菌活性的分析 |
| 3.3.3 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物构效关系分析 |
| 3.3.4 新型含氮杂环-喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的细胞毒性 |
| 3.4 小结 |
| 4 喹恶啉类化合物抗菌作用机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 蛋白酶 |
| 4.1.2 菌种与细胞 |
| 4.1.3 药品与试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 主要仪器和设备 |
| 4.1.6 DNA聚合酶Ⅰ活性抑制试验 |
| 4.1.7 酶动力学试验 |
| 4.1.8 DNA连接酶活性抑制试验 |
| 4.1.9 E.coli DNA Topoisomerase Ⅳ活性抑制试验 |
| 4.1.10 细胞复苏、传代和冻存 |
| 4.1.11 细胞毒性 |
| 4.1.12 体外结核杆菌感染巨噬细胞模型 |
| 4.1.13 细胞膜完整性检测 |
| 4.1.14 结核杆菌ATP水平测定 |
| 4.1.15 胞内氧自由基检测(cROS、mROS) |
| 4.1.16 qRT-PCR检测相关基因的mRNA表达 |
| 4.1.17 Western Blot方法测定蛋白表达水平 |
| 4.1.18 间接免疫荧光试验 |
| 4.1.19 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 DNA聚合酶Ⅰ活性抑制结果 |
| 4.2.2 DNA连接酶活性抑制试验 |
| 4.2.3 DNA拓扑异构酶活性抑制试验 |
| 4.2.4 新型喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物的细胞毒性 |
| 4.2.5 新型喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物干扰结核杆菌能量稳态的平衡 |
| 4.2.6 新型喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物诱导结核杆菌感染的巨噬细胞内氧自由基水平增加 |
| 4.2.7 新型喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物诱导结核杆菌感染的巨噬细胞自噬 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 喹恶啉类化合物对大肠杆菌作用机制的研究 |
| 4.3.2 喹恶啉类化合物对结核杆菌作用机制的研究 |
| 4.4 小结 |
| 5 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 研究生简介 |
| 附录Ⅱ 新型喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物核磁图谱 |
| 附录Ⅲ 新型喹恶啉-N~1,N~4-二氧化物核磁图谱 |
| 附录Ⅳ 菌种PCR鉴定 |
| 附录Ⅴ 文献综述 抗菌药物主要作用靶点的研究进展 |
（3）壳聚糖/藻酸盐微凝胶包载双歧杆菌联合小分子PD-L1抑制剂对原位直肠癌的抗肿瘤研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 肠道细菌通过影响免疫细胞调节免疫治疗 |
| 2.1.1 肠道细菌调控T细胞的变化 |
| 2.1.1.1 辅助性T细胞 |
| 2.1.1.2 Tregs |
| 2.1.1.3 细胞毒性T细胞 |
| 2.1.1.4 记忆性T细胞 |
| 2.1.2 肠道细菌对抗原呈递细胞(Antigen presenting cells,APCs)的调节 |
| 2.1.2.1 DCs |
| 2.1.2.2 巨噬细胞 |
| 2.1.2.3 B细胞 |
| 2.1.2.4 其他细胞 |
| 2.2 用以包载递送肠道细菌的生物材料 |
| 2.2.1 用于递送双歧杆菌的生物材料 |
| 2.2.2 用于递送鼠李糖乳杆菌的生物材料 |
| 2.2.3 用于递送大肠杆菌的生物材料 |
| 2.2.4 用于递送植物乳杆菌的生物材料 |
| 2.2.5 用于递送干酪乳杆菌的生物材料 |
| 2.2.6 用于递送其它细菌的生物材料 |
| 2.2.7 用于递送细菌DNA的生物材料 |
| 2.3 总结与展望 |
| 第3章 体外层面探究双歧杆菌抗肿瘤功效 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料及仪器设备 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 细胞培养 |
| 3.1.2.2 细菌培养 |
| 3.1.2.3 细菌菌落计数 |
| 3.1.2.4 细胞活力测定 |
| 3.1.2.5 液相色谱-质谱联用(Liquid Chromatography-massspectrometry,LC-MS)检测细菌菌液SCFA |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 双歧杆菌菌液杀伤肿瘤细胞功能的体外检测 |
| 3.2.2 双歧杆菌菌液SCFA检测 |
| 3.3 小结 |
| 第4章 壳聚糖/藻酸盐微凝胶包载双歧杆菌的制备与表征 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料及仪器设备 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.2.1 细菌培养 |
| 4.1.2.2 细菌菌落计数 |
| 4.1.2.3 壳聚糖藻酸盐微凝胶制备 |
| 4.1.2.4 壳聚糖/藻酸盐微凝胶粒径与外观的表征 |
| 4.1.2.5 壳聚糖/藻酸盐微凝胶包载效果的表征 |
| 4.1.2.6 壳聚糖/藻酸盐微凝胶体外消化模拟实验 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 壳聚糖/藻酸盐微凝胶外观表征 |
| 4.2.2 壳聚糖/藻酸盐微凝胶包载效率的表征 |
| 4.2.3 壳聚糖/藻酸盐微凝胶体外模拟释放率及保护功效的表征 |
| 4.3 小结 |
| 第5章 双歧杆菌MPs用于直肠癌治疗中抗肿瘤效果的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料及仪器设备 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.1.2.1 细胞培养 |
| 5.1.2.2 细菌培养 |
| 5.1.2.3 细菌菌落计数 |
| 5.1.2.4 Balb/c小鼠原位直肠肿瘤模型构建 |
| 5.1.2.5 双歧杆菌MPs治疗CT26 小鼠原位直肠癌方案 |
| 5.1.2.6 肿瘤组织HE染色 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 双歧杆菌对CT26 直肠癌小鼠的肿瘤生长抑制功能 |
| 5.2.2 双歧杆菌对肿瘤坏死的调控 |
| 5.3 小结 |
| 第6章 双歧杆菌MPs联合PD-L1 小分子抑制剂进一步提高直肠癌免疫治疗的疗效 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料及仪器设备 |
| 6.1.2 实验方法 |
| 6.1.2.1 细胞培养 |
| 6.1.2.2 细菌培养 |
| 6.1.2.3 细菌菌落计数 |
| 6.1.2.4 Balb/c小鼠原位直肠肿瘤模型构建 |
| 6.1.2.5 活体成像监测体内肿瘤生长 |
| 6.1.2.6 治疗方案 |
| 6.1.2.7 流式细胞术监测免疫细胞水平 |
| 6.1.2.8 双歧杆菌肠道内RNA scope检测 |
| 6.1.2.9 肿瘤组织HE染色 |
| 6.1.2.10 肿瘤组织免疫荧光染色 |
| 6.2 结果与讨论 |
| 6.2.1 体内肿瘤生长情况检测 |
| 6.2.2 抗肿瘤相关细胞因子及粪便SCFA检测 |
| 6.2.3 生物安全性检测 |
| 6.2.4 免疫细胞流式细胞术检测 |
| 6.2.5 双歧杆菌体内定向聚集功能检测 |
| 6.2.6 双歧杆菌联合PD-L1抑制剂对肿瘤组织坏死的调控 |
| 6.3 小结 |
| 第7章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）高毒力肺炎克雷伯菌蛋白组学分析及其毒力标志物的鉴定研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 高毒力肺炎克雷伯菌流行病学分析 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 高毒力肺炎克雷伯菌和经典肺炎克雷伯菌蛋白组学分析 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 高毒力肺炎克雷伯菌鉴定方法学的建立及其性能评价 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 MALDI-TOF MS在临床微生物检验中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）新型仿生胃肠道生物反应器研制与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 人体胃肠道消化系统概述 |
| 1.2.1 口腔阶段 |
| 1.2.2 胃阶段 |
| 1.2.3 小肠阶段 |
| 1.2.4 大肠阶段 |
| 1.3 肠道微生物概述 |
| 1.3.1 人体共生微生物 |
| 1.3.2 肠道微生物与疾病 |
| 1.3.3 肠道微生物的营养偏好性 |
| 1.4 饮食成分与肠道气体概述 |
| 1.4.1 肠道气体简介 |
| 1.4.2 饮食成分简介 |
| 1.4.3 饮食成分与肠道气体关联特性 |
| 1.5 胃肠道生物反应器概述 |
| 1.5.1 静态和动态生物反应器 |
| 1.5.2 国内外胃肠道生物反应器研究进展 |
| 1.5.3 胃肠道生物反应器的特定应用程序 |
| 1.6 本论文研究意义和主要研究内容 |
| 1.6.1 立题依据及研究意义 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 第二章 仿生胃和小肠生物反应器研制及其体外消化研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 仿生胃生物反应器的设计与制作 |
| 2.2.1 仿生胃和小肠生物反应器结构外观 |
| 2.2.2 仿生硅胶胃和小肠的制作 |
| 2.2.3 反应器密封装置 |
| 2.2.4 仿生胃和小肠生物反应器控制系统 |
| 2.2.5 恒温控制系统 |
| 2.2.6 蠕动控制系统 |
| 2.2.7 补料和排空系统 |
| 2.2.8 p H控制系统 |
| 2.2.9 模拟吸收装置 |
| 2.3 仿生胃和小肠生物反应器的调试 |
| 2.3.1 材料与设备 |
| 2.3.2 混合时间的测定 |
| 2.3.3 胃内压的测定 |
| 2.3.4 硅胶胃破碎力的测定 |
| 2.3.5 排空能力的测定 |
| 2.3.6 食物在仿生胃和小肠生物反应器中的消化过程 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 仿生胃和小肠生物反应器样机的集成结构 |
| 2.4.2 仿生硅胶胃和小肠外观与结构 |
| 2.4.3 反应器智能化控制系统和云平台系统 |
| 2.4.4 混合时间评价 |
| 2.4.5 胃内压评价 |
| 2.4.6 破碎力评价 |
| 2.4.7 p H控制评价 |
| 2.4.8 排空效率评价 |
| 2.4.9 胃肠内表面积评价 |
| 2.4.10 食物在胃和小肠生物反应器中消化过程评价 |
| 2.4.11 本章小结 |
| 第三章 仿生大肠生物反应器研制及其粪便定植研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 仿生大肠生物反应器的设计与制作 |
| 3.2.1 仿生大肠生物反应器外观结构 |
| 3.2.2 仿生硅胶大肠的制作 |
| 3.2.3 反应器密封装置 |
| 3.2.4 仿生大肠生物反应器控制系统 |
| 3.2.5 恒温控制系统 |
| 3.2.6 蠕动控制系统 |
| 3.2.7 补料和排空系统 |
| 3.2.8 p H控制系统 |
| 3.2.9 模拟吸收装置 |
| 3.2.10 模拟吸水装置 |
| 3.3 仿生大肠生物反应器的调试 |
| 3.3.1 材料与设备 |
| 3.3.2 混合时间的测定 |
| 3.3.3 大肠内压的测定 |
| 3.3.4 发酵前气密性测定 |
| 3.3.5 无菌测定 |
| 3.3.6 酸碱平衡调节能力测定 |
| 3.3.7 粪便样本培养 |
| 3.3.8 OD_(600)测定和气体采集 |
| 3.3.9 有机酸含量测定 |
| 3.3.10 DNA提取和16S r RNA基因测序 |
| 3.3.11 统计方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 仿生大肠生物反应器样机的集成结构 |
| 3.4.2 仿生硅胶大肠外观与结构 |
| 3.4.3 智能化控制系统和云平台系统 |
| 3.4.4 混合时间评价 |
| 3.4.5 肠内压评价 |
| 3.4.6 模拟吸收评价 |
| 3.4.7 无菌验证评价 |
| 3.4.8 酸碱平衡能力评价 |
| 3.4.9 粪便微生物定植效果评价 |
| 3.4.10 本章小结 |
| 第四章 仿生大肠生物反应器中Akkermansia muciniphila的生长和代谢研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和培养基 |
| 4.2.2 静态培养方法 |
| 4.2.3 动态培养方法 |
| 4.2.4 生物量测定 |
| 4.2.5 代谢产物短链脂肪酸测定 |
| 4.2.6 细菌外膜蛋白提取方法和浓度测定 |
| 4.2.7 扫描电镜和透射电镜 |
| 4.2.8 细菌外膜相对厚度和直径测量 |
| 4.2.9 统计分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 静态培养与动态培养对A.muciniphila生物量及代谢产物的影响 |
| 4.3.2 静态培养和动态培养对A.muciniphila外观形态的影响 |
| 4.3.3 不同培养基对A.muciniphila生物量的影响 |
| 4.3.4 不同培养基对A.muciniphila代谢产物的影响 |
| 4.3.5 不同培养基对A.muciniphila外膜蛋白浓度的影响 |
| 4.3.6 不同培养基对A.muciniphila外膜厚度和直径长度的影响 |
| 4.3.7 本章小结 |
| 第五章 高抗性淀粉大米的不同加工方式对体外消化和肠道菌群影响研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料和试剂 |
| 5.2.2 制备米饭、米浆、米糕和爆米花 |
| 5.2.3 体外模拟消化 |
| 5.2.4 抗性淀粉和葡萄糖含量测定 |
| 5.2.5 淀粉消化的一阶动力学模型和LOS曲线 |
| 5.2.6 OD_(600)测定和气体采集 |
| 5.2.7 短链脂肪酸测定 |
| 5.2.8 DNA提取和16S r RNA基因测序 |
| 5.2.9 统计分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 不同加工方式对大米中抗性淀粉含量的影响 |
| 5.3.2 大米在体外胃和小肠消化过程中淀粉消化率曲线和LOS分析 |
| 5.3.3 OD_(600)和产气量变化 |
| 5.3.4 体外粪便发酵后SCFA变化 |
| 5.3.5 粪便微生物的多样性和相对丰度分析 |
| 5.3.6 本章小结 |
| 第六章 膳食脂肪酸对肠道气体分布的影响研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 模拟膳食培养基 |
| 6.2.2 气体检测系统 |
| 6.2.3 多腔室仿生大肠反应器发酵 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 基础和脂肪酸培养基对总气体分布的影响 |
| 6.3.2 基础和脂肪酸培养基对CO_2分布的影响 |
| 6.3.3 基础和脂肪酸培养基对H_2分布的影响 |
| 6.3.4 基础和脂肪酸培养基对H_2S分布的影响 |
| 6.3.5 基础和脂肪酸培养基对VOC分布的影响 |
| 6.3.6 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间相关成果清单 |
（6）膀胱癌相关泌尿系统菌群的特征解析、组织分布及差异细菌对膀胱癌细胞的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 膀胱癌患者尿液增强定量培养质谱鉴定与尿液菌群特征分析 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 研究方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第二部分 膀胱癌与癌旁组织菌群荧光原位杂交验证及组织菌群特征分析 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 研究方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第三部分 差异细菌对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期、凋亡的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 研究方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第四部分 膀胱癌患者尿液中不可培养细菌的质谱直接鉴定及拓展应用 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 研究方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文一 |
| 英文论文二 |
| 附原始图 |
（7）基于“中药多糖-产丁酸菌”研究健脾方参苓白术散的微生态机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 一株肠道产丁酸菌的分离与鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 样本 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 粪便样本采集 |
| 2.2 培养基配置 |
| 2.3 菌株分离 |
| 2.4 产酸实验与革兰氏染色实验 |
| 2.5 气相色谱分析 |
| 2.6 菌株16S rRNA基因鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 水浴筛菌结果 |
| 3.2 产酸实验与革兰氏染色实验结果 |
| 3.3 气相色谱分析结果 |
| 3.4 菌株16S rRNA基因鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第二章 基于一株分离的产丁酸菌进行全基因组分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 测序数据质控 |
| 2.2 菌株RAZ1测序方法 |
| 2.3 基因组组装与预测 |
| 2.4 基因功能注释 |
| 2.5 菌株RAZ1代谢系统分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 测序数据质控结果 |
| 3.2 菌株RAZ1基因组装结果与基因预测 |
| 3.3 菌株RAZ1基因功能注释分析结果 |
| 3.4 菌株RAZ1的碳水化合物活性酶注释结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 基于“产丁酸菌群”研究参苓白术散治疗AAD动物模型的微生态机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药材 |
| 1.3 菌株 |
| 1.4 试剂 |
| 1.5 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 AAD模型构建和参苓白术散治疗 |
| 2.2 粪便样品采集 |
| 2.3 粪便细菌总DNA提取 |
| 2.4 产丁酸菌群功能基因PCR扩增 |
| 2.5 功能基因PCR产物文库构建和测序 |
| 2.6 功能基因进化树构建 |
| 3 结果 |
| 3.1 AAD模型构建及治疗结果 |
| 3.2 AAD大鼠肠道产丁酸菌群OTU变化结果 |
| 3.3 AAD大鼠肠道产丁酸菌群门、属水平结构变化结果 |
| 3.4 AAD大鼠肠道产丁酸菌群进化树分析结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 基于“产丁酸菌”组合“拟杆菌/厚壁菌”研究参苓白术散中药多糖的降解机制及对产丁酸含量的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 药材 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 参苓白术散多糖的提取及含量测定 |
| 2.2 细菌鉴定 |
| 2.3 细菌厌氧培养 |
| 2.4 细菌OD600与细菌数量换算 |
| 2.5 连续取样进行气相色谱检分析测正丁酸浓度 |
| 3 结果 |
| 3.1 细菌鉴定结果 |
| 3.2 正丁酸标准曲线结果 |
| 3.3 产丁酸菌在“参苓白术散PM”中的生长曲线与产丁酸曲线测定结果 |
| 3.4 产丁酸菌在“经过脆弱拟杆菌降解的参苓白术散PM降解液”中的生长曲线测定结果与产丁酸浓度曲线结果 |
| 3.5 产丁酸菌在“经过多形拟杆菌降解后的参苓白术散PM降解液”中的生长曲线测定结果与产丁酸浓度曲线结果 |
| 3.6 产丁酸菌在“经过厚壁菌YT2降解后的参苓白术散多糖碳源培养基”中的生长曲线测定结果与产丁酸浓度曲线结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 基于“产丁酸菌——中药多糖”的中药药理研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（8）功能材料增强细菌生物活性用于疾病治疗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 微生物在疾病治疗中的应用 |
| 1.2.1 细菌在疾病治疗中的应用 |
| 1.2.2 病毒在疾病治疗中的应用 |
| 1.2.3 真菌在疾病治疗中的应用 |
| 1.2.4 微藻在疾病治疗中的应用 |
| 1.3 功能材料修饰微生物治疗疾病 |
| 1.3.1 功能材料修饰微生物治疗疾病的应用及优势 |
| 1.3.2 功能材料修饰微生物治疗疾病的挑战及发展方向 |
| 1.4 选题思路 |
| 参考文献 |
| 第二章 线粒体靶向MOFs杂化光热细菌增强肿瘤光热治疗 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 细菌培养及PTB制备 |
| 2.2.3 ZIF-90、ZIF-90/MB、PTB@ZIF-90/MB的制备与表征 |
| 2.2.4 细胞培养及细胞毒性、细胞活/死染色、细胞凋亡测试 |
| 2.2.5 细胞线粒体功能、细胞内ATP水平及细胞HSPs表达测试 |
| 2.2.6 细胞内ROS水平测试 |
| 2.2.7 小鼠肿瘤模型建立及活体成像 |
| 2.2.8 活体动物抗肿瘤实验 |
| 2.2.9 生物安全性评价 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 PTB的制备与表征 |
| 2.3.2 PTB的光热性能 |
| 2.3.3 ZIF-90与ZIF-90/MB的制备与表征 |
| 2.3.4 ZIF-90/MB的 ATP响应释放及ROS产生 |
| 2.3.5 ZIF-90/MB造成线粒体功能紊乱、减少ATP合成及下调HSPs表达 |
| 2.3.6 PTB@ZIF-90/MB的制备与表征 |
| 2.3.7 PTB@ZIF-90/MB增强的体外光热效果 |
| 2.3.8 PTB@ZIF-90/MB的活体肿瘤靶向 |
| 2.3.9 PTB@ZIF-90/MB的活体抗肿瘤 |
| 2.3.10 PTB@ZIF-90/MB的生物安全性评价 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 二氧化锰纳米花杂化细菌耦合细菌呼吸与肿瘤代谢抑制肿瘤进程 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂及仪器 |
| 3.2.2 细菌及细胞培养 |
| 3.2.3 XPS表征锰还原 |
| 3.2.4 MnO_2纳米花、MnO_2-COOH及 Bac@MnO_2的合成及表征 |
| 3.2.5 电化学测试 |
| 3.2.6 乳酸浓度检测 |
| 3.2.7 细胞培养及细胞毒性实验 |
| 3.2.8 活体肿瘤模型建立及活体成像实验 |
| 3.2.9 脏器及肿瘤中Mn含量的测试 |
| 3.2.10 活体抗肿瘤实验 |
| 3.2.11 生物安全性实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 细菌分解代谢乳酸验证 |
| 3.3.2 材料的合成及表征 |
| 3.3.3 Bac@MnO_2消耗乳酸及催化氧气产生 |
| 3.3.4 细胞毒性及在细胞培养基中的乳酸消耗 |
| 3.3.5 活体肿瘤靶向 |
| 3.3.6 生物安全性评价 |
| 3.3.7 活体肿瘤抑制效果评价 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 益生元-益生菌孢子微球通过生物夺氧选择性抑制肠道病原菌爆发缓解肠炎 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 细菌培养及芽孢分离 |
| 4.2.3 Sp-Cur的合成及表征 |
| 4.2.4 KGM的改性及表征 |
| 4.2.5 CPK微球的制备及表征 |
| 4.2.6 孢子活性评估实验 |
| 4.2.7 Sp-Cur的萌发耗氧及抗氧化表征实验 |
| 4.2.8 肠炎模型的建立及CPK活体肠炎靶向实验 |
| 4.2.9 CPK肠炎小鼠肠道氧气消耗及大肠杆菌生长抑制实验 |
| 4.2.10 急性肠炎治疗实验 |
| 4.2.11 先诱导后治疗急性肠炎实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 芽孢的提取及Sp-Cur的合成 |
| 4.3.2 KGM的改性 |
| 4.3.3 CPK的制备 |
| 4.3.4 CPK肠炎靶向及抑制肠道大肠杆菌增殖 |
| 4.3.5 急性肠炎治疗 |
| 4.3.6 先诱导后治疗急性肠炎 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 作者在攻读博士学位期间已发表和待发表的论文 |
| 致谢 |
（9）基于静态顶空分析技术评价天然产物活性新方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 天然药物的发展 |
| 1.1.1 植物源天然药物 |
| 1.1.2 海洋天然药物 |
| 1.2 天然产物是抗菌、抗肿瘤新药开发的源泉 |
| 1.3 抗菌活性方法 |
| 1.3.1 抑菌活性体内测定 |
| 1.3.2 抑菌活性体外测定 |
| 1.3.3 抗菌活性评价的标准化 |
| 1.4 抗肿瘤活性 |
| 1.4.1 细胞增殖活性检测的意义 |
| 1.4.2 细胞增殖活性检测常用的方法 |
| 1.5 顶空气相色谱技术 |
| 1.5.1 顶空气相色谱技术在微生物检测方面的应用 |
| 1.6 本研究的目的意义和主要研究内容 |
| 1.6.1 本研究的目的和意义 |
| 1.6.2 本论文的主要内容 |
| 第2章 基于顶空分析技术的天然产物对需氧菌抗菌活性测定方法的建立和应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂与材料 |
| 2.2.2 设备和操作 |
| 2.2.3 利用HS-GC-TCD对 CO2的线性响应测定 |
| 2.2.4 抑菌活性的测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 本方法的原理 |
| 2.3.2 药物对细菌生长的影响 |
| 2.4 方法评价 |
| 2.4.1 精密度 |
| 2.4.2 准确性 |
| 2.5 抑菌活性新方法的应用——最低抑菌浓度的测定 |
| 2.5.1 细菌接种量的影响 |
| 2.5.2 不同培养时间对细菌数量的影响 |
| 2.5.3 药物对细菌生长的影响 |
| 2.5.4 最低抑菌浓度的测定 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 基于顶空分析技术测定药物的抗厌氧菌活性方法和应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂与材料 |
| 3.2.2 设备和操作 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 除氧装置的结果与讨论 |
| 3.3.2 关于药物抗厌氧菌活性新方法的结果与讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 基于顶空气相色谱法测定肿瘤细胞增殖活性的方法 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试剂与材料 |
| 4.2.2 主要仪器与耗材 |
| 4.2.3 体外细胞培养方法 |
| 4.2.4 仪器操作与设置 |
| 4.2.5 顶空瓶密闭培养对细胞的影响 |
| 4.2.6 细胞生长曲线 |
| 4.2.7 药物对细胞活性的影响 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 顶空瓶密闭培养对细胞的影响 |
| 4.3.2 细胞生长曲线 |
| 4.3.3 方法评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 本论文的主要结论 |
| 5.2 本论文的创新之处 |
| 5.3 对未来工作的建议 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（10）基于MALDI-TOF MS对血流感染病原菌的快速鉴定及药敏试验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 MALDI-TOF-MS在病原微生物鉴定中的应用 |
| 1.1.1 培养后病原菌的鉴定 |
| 1.1.2 临床样本直接检测细菌 |
| 1.2 MALDI-TOF MS在细菌耐药性检测中的研究与应用 |
| 1.2.1 直接分析法 |
| 1.2.2 酶水解法 |
| 1.2.3 曲线下面积法 |
| 1.2.4 其他方法 |
| 1.3 质谱在流行病学中的应用 |
| 1.4 质谱在其他方面的运用 |
| 1.5 研究目的 |
| 1.6 研究方案 |
| 1.7 预期目标 |
| 第二章 评估国产质谱仪(毅星博创Clin-TOF-ⅡMS)对血培养阳性标本的直接鉴定能力 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 血培养标本来源 |
| 2.2.2 主要试剂和材料 |
| 2.2.3 仪器设备 |
| 2.2.4 溶液配置 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 传统纯培养法 |
| 2.3.2 Clin-TOF-ⅡMS直接检测法 |
| 2.3.3 数据处理与统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 菌株收集情况 |
| 2.4.2 传统纯培养法鉴定结果 |
| 2.4.3 直接检测法鉴定结果 |
| 2.4.4 不同类型血培养瓶的鉴定结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对碳青霉烯酶的快速检测 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 模拟实验菌株来源 |
| 3.2.2 血培养标本来源 |
| 3.2.3 主要试剂和材料 |
| 3.2.4 仪器设备 |
| 3.2.5 溶液配置 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 血培养模拟试验 |
| 3.3.2 临床标本验证试验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 模拟试验的鉴定结果 |
| 3.4.2 美罗培南峰和水解峰 |
| 3.4.3 临床标本鉴定结果 |
| 3.4.4 临床标本水解法药敏试验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 1 作者简历 |
| 2 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文数据集 |
四、细菌自动培养仪厌氧培养的临床应用（论文参考文献）
- [1]血液培养技术用于血流感染诊断临床实践专家共识[J]. 中国医疗保健国际交流促进会临床微生物与感染分会,中华医学会检验医学分会临床微生物学组,中华医学会微生物学和免疫学分会临床微生物学组. 中华检验医学杂志, 2022(02)
- [2]具有抗菌活性的新型喹恶啉-N1, N4-二氧化物的设计、合成和作用机制研究[D]. 张鹤营. 华中农业大学, 2021(02)
- [3]壳聚糖/藻酸盐微凝胶包载双歧杆菌联合小分子PD-L1抑制剂对原位直肠癌的抗肿瘤研究[D]. 刘亦伦. 吉林大学, 2021(01)
- [4]高毒力肺炎克雷伯菌蛋白组学分析及其毒力标志物的鉴定研究[D]. 林佳. 福建医科大学, 2021(02)
- [5]新型仿生胃肠道生物反应器研制与应用[D]. 李志涛. 江南大学, 2021(01)
- [6]膀胱癌相关泌尿系统菌群的特征解析、组织分布及差异细菌对膀胱癌细胞的作用研究[D]. 李伟. 山东大学, 2021(12)
- [7]基于“中药多糖-产丁酸菌”研究健脾方参苓白术散的微生态机制[D]. 林萍. 江西中医药大学, 2021(01)
- [8]功能材料增强细菌生物活性用于疾病治疗的研究[D]. 陈其文. 武汉大学, 2021(02)
- [9]基于静态顶空分析技术评价天然产物活性新方法的研究[D]. 李梦辉. 中国科学院大学(中国科学院武汉植物园), 2020(01)
- [10]基于MALDI-TOF MS对血流感染病原菌的快速鉴定及药敏试验研究[D]. 胡洁. 浙江工业大学, 2019(03)