扈江伟[1]2004年在《骨髓间充质干细胞在小鼠异基因骨髓移植中免疫调节作用的初步研究》文中提出近30年来，异基因骨髓移植(Allo-BMT)已经成功应用于治疗恶性血液病、免疫缺陷病和遗传异常造血祖细胞引起的疾病。至今为止，移植物抗宿主病(GVHD)仍是移植相关死亡的主要原因，是移植的首要障碍。特别是在接受HLA配型完全相合的无关供者移植的患者中，常发生严重的急性GVHD。虽然应用免疫抑制药物和T细胞去除的方法能有效的控制GVHD，但治疗的同时会引起严重的并发症，诸如感染和增加白血病复发风险。因此许多学者已经在寻找开发一些防止GVHD同时避免免疫抑制引起的并发症的方法。骨髓间充质干细胞(MSC)是骨髓中能分化为成骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，具有多向分化的前体细胞。在对NOD／SCID小鼠的一些研究中显示，移植时共输注MSC能增强人造血细胞在NOD／SCID小鼠骨髓中的植入。MSC能产生许多促进造血细胞归巢或增殖和分化的细胞因子，因此在促进造血恢复中发挥重要的作用。而且，MSC是弱的抗原提呈细胞，不表达MHCⅡ类分子或共刺激分子。通过MSC能够在体外抑制混合淋巴细胞反应(MLR)的实验结果说明，MSC也具有免疫调节的特性。在狒狒皮肤移植物排斥模型中，与无MSC输注的控制组相比，体内共输注MSC组狒狒的皮肤移植物生存时间延长了。本实验的研究目的是初步探讨小鼠MSC在小鼠异基因骨髓移植中的免疫调节作用。首先分离、培养并通过流式细胞仪和细胞组织化学来鉴定小鼠MSC：通过输注不同的供鼠脾细胞建立了小鼠GVHD模型；最后，我们观察了小鼠MSC共输注对小鼠GVHD的免疫调节作用。结果表明，分离、扩增培养至第四代之后的MSC细胞形态均一，高表达Sca-1，CD29，CD44． 和CD105，而几乎不表达CD34和CD45等造血与内皮细胞特异性表面标志；在特殊的诱导体系中小鼠MSC可向脂肪细胞和成骨细胞分化。给予5×106个以上的供者脾细胞均能诱导出典型的急性GVHD，但输注脾细胞数高的小鼠出现GVHD的时间早且症状重。受鼠MSC(5×104) 与供鼠脾细胞(5×106) 共输注组或供者MSC(1×106) 与供鼠脾细胞(5×107) 共输注组的小鼠生存时间与对照组均无明显差异，但GVHD表现更严 硕士学位论文:中文摘要重。我们的结论是:①采用骨髓细胞与骨碎片共培养能够成功地分离及培养出小鼠MSC;②建立了小鼠异基因骨髓移植的GVHD模型;③培养扩增的小鼠MSC与造血细胞共输注加重了GVHD的程度，可能与MSC输注的数量少和归巢能力差有关，说明MSC的免疫调节功能在体内可能受到许多因素的影响，仍需进一步深入研究。
唐晓琼[2]2006年在《骨髓间充质干细胞的IDO对小鼠异基因骨髓移植中GVHD效应影响的实验研究》文中认为近30年来,异基因骨髓移植(allogeneic bone marrow transplantation ,Allo-BMT)已经成功应用于治疗恶性血液病、严重免疫缺陷病和骨髓造血功能衰竭等疾病。至今为止,急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease ,aGVHD)仍是移植相关死亡的主要原因,是移植的主要障碍。特别是在接受HLA配型不全相合的无关供者移植的患者中,常发生严重的急性GVHD。虽然应用免疫抑制药物和T细胞去除的方法能有效的控制GVHD,但治疗的同时会引起严重的并发症,比如感染和增加疾病复发风险。因此许多研究者一直致力于寻找一些防止GVHD发生并能避免免疫抑制引起的并发症的方法。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells , MSCs)是骨髓中能分化为成骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞,具有多向分化潜能的细胞。研究已经证实MSCs能产生许多促进造血细胞归巢、增殖和分化的细胞因子,因此在促进造血恢复中发挥重要的作用。而且,MSCs不表达MHC II类分子或共刺激分子,具有较弱的抗原性。研究也表明MSCs具有免疫调节的特性,可以减轻GVHD。但对于MSCs发挥免疫负调节作用、减轻GVHD的机制仍不清楚。吲哚胺2,3-过氧化酶(indoleamine 2,3-dioxygenase IDO)是色氨酸沿犬尿氨酸代谢途径降解的限速酶.可以降解T细胞周围的色氨酸。而T细胞的细胞周期中有一个对周围色氨酸水平极为敏感的调节点,色氨酸的缺乏使其停滞在mid-G1期,从而抑制活化的T细胞的增殖。在IFN-γ的作用下,机体内的多种细胞如成纤维细胞、上皮细胞、巨噬细胞均可产生IDO。近来,人们还发现母胎界面滋养层细胞中IDO在避免胎儿受母体排斥中具有重要作用。因此,抗原提呈细胞上的IDO被公认为抑制机体T细胞对异体抗原发生免疫应答的主要机制之一。基于此,我们试图体外分离培养及扩增小鼠的MSCs,检测IFN-γ作用下的MSCs上IDO mRNA和IDO蛋白的表达,以及IDO在MSCs介导同种混合淋巴细胞增殖反应的作用;通过建立小鼠异基因骨髓移植模型,观察具有IDO表达的MSCs在小鼠异基因骨髓移植中抑制同种异体免疫反应、降低GVHD发生的体内效果,探讨MSCs的IDO活性参与MSCs发挥免疫负调节作用的机理,为临床MSCs防治GVHD提供可靠的实验依据。第一部分小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性的研究目的:探讨小鼠骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)的体外分离、纯化、扩增和多向分化条件。方法:获取小鼠骨髓细胞,以IMDM作为培养基进行培养和纯化细胞,瑞氏染色和电镜观察形态;FACS检测其免疫表型和细胞周期;体外诱导成骨细胞、脂肪细胞、神经样细胞分化,Von Kossa染色、油红O染色、免疫组织化学法检测细胞向成骨、成脂肪细胞、神经样细胞分化情况。结果:小鼠骨髓来源的细胞呈纤维样贴壁生长,瑞氏染色和电镜观察具有MSCs特征;FACS检测结果显示,表达MSCs相关的抗原CD29、CD44、CD105,而CD31、CD13、CD34、CD45、I-ab为阴性;体外诱导成骨细胞、脂肪细胞、神经样细胞分化成功。结论:体外成功地分离及培养了小鼠MSCs。第二部分IDO在小鼠骨髓间充质干细胞的表达及对T细胞增殖的影响目的:探讨γ-干扰素(IFN-γ)作用下小鼠MSCs上吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)表达情况及其活性对异基因T淋巴细胞增殖的影响。方法:以不同浓度的IFN-γ(0、20、50、100、200 U/ml)作用小鼠MSCs,以RT-PCR和Western blot分别检测IDO mRNA和IDO蛋白表达,以反相高效液相色谱法(HPLC)检测IDO活性;分别以丝裂霉素C灭活的C57BL/ 6鼠脾细胞为刺激细胞,BALB/C鼠脾细胞为反应细胞建立混合淋巴细胞培养体系(MLRs)。有或无1-甲基色氨酸(1-MT)存在下, MSCs/ MLRs共培养体系中C57BL/ 6鼠MSCs为1×105、5×104、1×104、5×103(MSCs:反应T细胞数量比为1:5,1:10,1:50,1:100)。以MTT法检测T淋巴细胞增殖率,HPLC法检测各MLRs体系上清中IDO活性。结果: IFN-γ作用后, MSCs出现IDO mRNA、IDO蛋白表达以及功能性的IDO活性,且IDO mRNA、IDO蛋白表达量和IDO活性与IFN-γ浓度呈剂量依赖性;当MSCs为1×10~5、5×10~4、1×10~4(即MSCs:反应T细胞为1:5,1:10,1:50)时,与对照组比较,T淋巴细胞的增殖率显着降低(P<0.05),IDO活性显着升高(P<0.05);加入1-甲基色氨酸(1-MT)后,T淋巴细胞的增殖率及IDO活性均恢复。当MSCs为5×103(即MSCs:反应T细胞为1:100)时,与对照组比较,T淋巴细胞的增殖率轻度升高(P>0.05),IDO活性无明显变化(P>0.05)。结论: MSCs上的IDO表达与T淋巴细胞的增殖密切相关,MSCs在体外可能通过IDO活性发挥免疫抑制作用。第叁部分小鼠异基因骨髓移植急性移植物抗宿主病模型的建立目的:建立小鼠异基因骨髓移植急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型,为下一步异基因骨髓移植中aGVHD研究提供理想的实验参照。方法:采用近亲系的雄性C57BL/6(H-2b)小鼠为供鼠、60Co致死量照射的雌性BALB/C(H-2d)小鼠为受鼠建立异基因骨髓移植模型,以混合移植2:1的异基因骨髓细胞与外周脾细胞作为aGVHD组,同时设立空白对照组(无骨髓细胞及外周脾细胞植入)和单纯Allo-BMT组(无外周脾细胞植入)。根据临床表现、存活期及病理改变等判断GVHD程度。结果:单纯Allo-BMT组无典型的急性GVHD表现;aGVHD组受鼠GVHD的临床评分在10分左右,存活期6-24天,临床和病理均可在相对集中的时间内观察到典型的急性GVHD改变。结论:成功地建立了小鼠异基因骨髓移植急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型。第四部分MSCs的IDO对小鼠异基因骨髓移植中aGVHD效应的影响目的:观察具有IDO表达的MSCs在小鼠异基因骨髓移植中降低aGVHD发生的体内效果,探讨MSCs上的IDO活性参与其发挥免疫抑制作用的机制。方法:采用近亲系的雄性C57BL/6(H-2b)小鼠为供鼠、60Co致死量照射的雌性BALB/C(H-2d)小鼠为受鼠建立不同的移植组:aGVHD组(A组)、大剂量MSCs组(B组)、小剂量MSCs组(C组)和1-MT预处理组(D组)。根据临床表现和病理改变判断GVHD程度,并比较不同移植组的存活率、GVHD发生情况和Th1类细胞因子(IL-2、IFN-γ)和Th2类(IL-4、IL-10)细胞因子分泌情况。结果: B组受鼠,GVHD的临床评分在4分左右,无组织病理改变,全部长期存活,与A组比较差异显着(P<0.05)。与A组比较,B组受鼠血清中Th1类细胞因子显着降低,Th2类细胞因子显着升高(P<0.05)。A、C、D叁组之间的GVHD临床评分、病理变化、生存率及细胞因子水平无统计学差异(P>0.05)。结论:在小鼠Allo-BMT中,同种异基因MSCs的IDO活性可促进Thl向Th2的偏离,进而产生抑制GVHD效应,推测MSCs在体内同样通过IDO活性发挥免疫抑制作用。
唐晓琼[3]2006年在《骨髓间充质干细胞的IDO对小鼠异基因骨髓移植中aGVHD效应影响的实验研究》文中进行了进一步梳理近30年来，异基因骨髓移植(allogeneic bone marrow transplantation，Allo-BMT)已经成功应用于治疗恶性血液病、严重免疫缺陷病和骨髓造血功能衰竭等疾病。至今为止，急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease，aGVHD)仍是移植相关死亡的主要原因，是移植的主要障碍。特别是在接受HLA配型不全相合的无关供者移植的患者中，常发生严重的急性GVHD。虽然应用免疫抑制药物和T细胞去除的方法能有效的控制GVHD，但治疗的同时会引起严重的并发症，比如感染和增加疾病复发风险。因此许多研究者一直致力于寻找一些防止GVHD发生并能避免免疫抑制引起的并发症的方法。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓中能分化为成骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，具有多向分化潜能的细胞。研究已经证实MSCs能产生许多促进造血细胞归巢、增殖和分化的细胞因子，因此在促进造血恢复中发挥重要的作用。而且，MSCs不表达MHCⅡ类分子或共刺激分子，具有较弱的抗原性。研究也表明MSCs具有免疫调节的特性，可以减轻GVHD。但对于MSCs发挥免疫负调节作用、减轻GVHD的机制仍不清楚。吲哚胺2，3-过氧化酶(indoleamine 2，3-dioxygenase IDO)是色氨酸沿犬尿氨酸代谢途径降解的限速酶。可以降解T细胞周围的色氨酸。而T细胞的细胞周期中有一个对周围色氨酸水平极为敏感的调节点，色氨酸的缺乏使其停滞在mid-G_1期，从而抑制活化的T细胞的增殖。在IFN-γ的作用下，机体内的多种细胞如成纤维细胞、上皮细胞、巨噬细胞均可产生IDO。近来，人们还发现母胎界面滋养层细胞中IDO在避免胎儿受母体排斥中具有重要作用。因此，抗原提呈细胞上的IDO被公认为抑制机体T细胞对异体抗原发生免疫应答的主要机制之一。基于此，我们试图体外分离培养及扩增小鼠的MSCs，检测IFN-γ作用下的MSCs上IDO mRNA和IDO蛋白的表达，以及IDO在MSCs介导同种混合淋巴细胞增殖反应的作用；通过建立小鼠异基因骨髓移植模型，观察具有IDO表达的MSCs在小鼠异基因骨髓移植中抑制同种异体免疫反应、降低GVHD发生的体内效果，探讨MSCs的IDO活性参与MSCs发挥免疫负调节作用的机理，为临床MSCs防治GVHD提供可靠的实验依据。第一部分小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性的研究目的：探讨小鼠骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)的体外分离、纯化、扩增和多向分化条件。方法：获取小鼠骨髓细胞，以IMDM作为培养基进行培养和纯化细胞，瑞氏染色和电镜观察形态；FACS检测其免疫表型和细胞周期；体外诱导成骨细胞、脂肪细胞、神经样细胞分化，Von Kossa染色、油红O染色、免疫组织化学法检测细胞向成骨、成脂肪细胞、神经样细胞分化情况。结果：小鼠骨髓来源的细胞呈纤维样贴壁生长，瑞氏染色和电镜观察具有MSCs特征；FACS检测结果显示，表达MSCs相关的抗原CD29、CD44、CD105，而CD31、CD13、CD34、CD45、I-a~b为阴性；体外诱导成骨细胞、脂肪细胞、神经样细胞分化成功。结论：体外成功地分离及培养了小鼠MSCs。第二部分IDO在小鼠骨髓间充质干细胞的表达及对T细胞增殖的影响目的：探讨γ-干扰素(IFN-γ)作用下小鼠MSCs上吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)表达情况及其活性对异基因T淋巴细胞增殖的影响。方法：以不同浓度的IFN-γ(0、20、50、100、200 U／ml)作用小鼠MSCs，以RT-PCR和Western blot分别检测IDO mRNA和IDO蛋白表达，以反相高效液相色谱法(HPLC)检测IDO活性；分别以丝裂霉素C灭活的C57BL／6鼠脾细胞为刺激细胞，BALB／C鼠脾细胞为反应细胞建立混合淋巴细胞培养体系(MLRs)。有或无1-甲基色氨酸(1-MT)存在下，MSCs／MLRs共培养体系中C57BL／6鼠MSCs为1×10~5、5×10~4、1×10~4、5×10~3(MSCs：反应T细胞数量比为1：5，1：10，1：50，1：100)。以MTT法检测T淋巴细胞增殖率，HPLC法检测各MLRs体系上清中IDO活性。结果：IFN-γ作用后，MSCs出现IDO mRNA、IDO蛋白表达以及功能性的IDO活性，且IDO mRNA、IDO蛋白表达量和IDO活性与IFN-γ浓度呈剂量依赖性；当MSCs为1×10~5、5×10~4、1×10~4(即MSCs：反应T细胞为1：5，1：10，1：50)时，与对照组比较，T淋巴细胞的增殖率显着降低(P＜0.05)，IDO活性显着升高(P＜0.05)；加入1-甲基色氨酸(1-MT)后，T淋巴细胞的增殖率及IDO活性均恢复。当MSCs为5×10~3(即MSCs：反应T细胞为1：100)时，与对照组比较，T淋巴细胞的增殖率轻度升高(P＞0.05)，IDO活性无明显变化(P＞0.05)。结论：MSCs上的IDO表达与T淋巴细胞的增殖密切相关，MSCs在体外可能通过IDO活性发挥免疫抑制作用。第叁部分小鼠异基因骨髓移植急性移植物抗宿主病模型的建立目的：建立小鼠异基因骨髓移植急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型，为下一步异基因骨髓移植中aGVHD研究提供理想的实验参照。方法：采用近亲系的雄性C57BL／6(H-2~b)小鼠为供鼠、~(60)Co致死量照射的雌性BALB／C(H-2~d)小鼠为受鼠建立异基因骨髓移植模型，以混合移植2：1的异基因骨髓细胞与外周脾细胞作为aGVHD组，同时设立空白对照组(无骨髓细胞及外周脾细胞植入)和单纯Allo-BMT组(无外周脾细胞植入)。根据临床表现、存活期及病理改变等判断GVHD程度。结果：单纯Allo-BMT组无典型的急性GVHD表现；aGVHD组受鼠GVHD的临床评分在10分左右，存活期6—24天，临床和病理均可在相对集中的时间内观察到典型的急性GVHD改变。结论：成功地建立了小鼠异基因骨髓移植急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型。第四部分MSCs的IDO对小鼠异基因骨髓移植中aGVHD效应的影响目的：观察具有IDO表达的MSCs在小鼠异基因骨髓移植中降低aGVHD发生的体内效果，探讨MSCs上的IDO活性参与其发挥免疫抑制作用的机制。方法：采用近亲系的雄性C57BL／6(H-2~b)小鼠为供鼠、~(60)Co致死量照射的雌性BALB／C(H-2~d)小鼠为受鼠建立不同的移植组：aGVHD组(A组)、大剂量MSCs组(B组)、小剂量MSCs组(C组)和1-MT预处理组(D组)。根据临床表现和病理改变判断GVHD程度，并比较不同移植组的存活率、GVHD发生情况和Th1类细胞因子(IL-2、IFN-γ)和Th2类(IL-4、IL-10)细胞因子分泌情况。结果：B组受鼠，GVHD的临床评分在4分左右，无组织病理改变，全部长期存活，与A组比较差异显着(P＜0.05)。与A组比较，B组受鼠血清中Th1类细胞因子显着降低，Th2类细胞因子显着升高(P＜0.05)。A、C、D叁组之间的GVHD临床评分、病理变化、生存率及细胞因子水平无统计学差异(P＞0.05)。结论：在小鼠Allo-BMT中，同种异基因MSCs的IDO活性可促进Th1向Th2的偏离，进而产生抑制GVHD效应，推测MSCs在体内同样通过IDO活性发挥免疫抑制作用。
边莉[4]2006年在《HGF基因修饰的MSC生物学特性及免疫调控作用研究》文中指出间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)可通过细胞间作用及分泌细胞因子(HGF、TGF-β等)抑制淋巴细胞增殖，与造血干细胞共移植能够减低GVHD的发生。肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)在小鼠异基因骨髓移植模型中具有免疫抑制和修复损伤作用，从多环节减轻GVHD的发生，同时保留GVL效应。为明确MSC和HGF基因两者联合是否具有免疫协同效应，我们开展了HGF基因修饰MSC免疫调控作用的研究。期望为HGF基因修饰骨髓间充质干细胞防治GVHD提供实验基础。 我们利用Percoll密度梯度离心与贴壁培养扩增人骨髓来源的MSC，利用酶消化后骨片培养的方法分离纯化小鼠骨来源的MSC。上述细胞均呈贴壁生长的成纤维细胞样形态，表型特征分析显示细胞为非造血非内皮细胞群，分化试验证明细胞具有体外成骨和成脂肪能力，说明获得的细胞符合MSC的确认“标准”。 在此基础上，我们观察了HGF基因转染对MSC生物学特性的影响。首先，利用携带GFP基因的腺病毒载体(Ad-GFP)感染MSC，以GFP为报告基因，确定了重组腺病毒对MSC的感染效率。流式检测结果表明，腺病毒感染强度MOI为150时，感染效率几乎达到了100％；我们利用相同MOI的Ad-HGF感染MSC，用ELISA法检测HGF的分泌表达，结果表明感染后HGF可在短期内高效表达。提示腺病毒可以有效介导HGF在MSC中表达。 为确定HGF基因转染对MSC生物学特性的影响，我们检测了转HGF基因MSC(MSC-HGF)的细胞表型，结果表明转HGF基因不影响MSC表型，与未转染基因细胞相似，MSC-HGF仍表达CD29、CD73、CD105、CD166和HLA-ABC，不表达CD31、CD34、CD45以及HLA-DR。我们进一步检测了MSC-HGF的分化性能，诱导脂肪分化后油红O染色显示MSC-HGF体外成脂肪能力正常；诱导成骨分化后进行ALP活性染色和定量以及Ca沉积定量均表明MSC-HGF仍具有体外成骨能力；用地塞米松诱导后，在mRNA水平检测到成骨、脂肪和软骨分化相关基因的表达；另外，不诱导时MSC-HGF与MSC成骨、成软骨和成脂肪标志分子表达无差异，说明HGF基因修饰本身不引起间充质干细胞分化，并且不影响MSC
张彦明[5]2011年在《自然杀伤T细胞在异基因造血干细胞移植aGVHD中的免疫调控研究》文中研究说明目的:探讨小鼠体外Ⅰ型NKT细胞扩增培养体系的建立及体内实施α-GalCer负载的树突状细胞(α-GalCer-loaded DC)对小鼠NKT细胞的扩增活化效应。方法:C57BL/6小鼠脾细胞分别在含α-GalCer (100 ng/ml)、α-GalCer (100 ng/ml) + IL-2 (100 IU/ml)和α-GalCer (100 ng/ml) + IL-2 (100 IU/ml) + IL-7 (20 ng/ml)的体外扩增体系扩增培养。体内分2组分别注射α-GalCe(r2μg/mouse)和α-GalCer-loaded DC(1×106/mouse)扩增NKT细胞。采用α-GalCer-loaded CD1d tetramer和TCRβ单抗双标记流式细胞术检测NKT细胞比例,比较不同培养体系NKT细胞的扩增效率。免疫磁珠分选α-GalCer-loaded DC体内扩增的NKT细胞并进行纯度鉴定。ELISA法测定体内、体外扩增第7天小鼠血清、培养上清中的IL-4、IFNγ水平。结果:体外扩增培养第8天,α-GalCer、α-GalCer + IL-2、α-GalCer + IL-2 + IL-7叁组NKT细胞比例分别为(8.70±1.97)%、(27.28±5.26)%、(51.25±7.80)%,α-GalCer + IL-2和α-GalCer + IL-2 + IL-7较α-GalCer具有显着的统计学意义的(P<0.01),α-GalCer + IL-2 + IL-7较α-GalCer + IL-2扩增比例显着增加(P=0.0327)。体内扩增体系中,α-GalCer组和α-GalCer-loaded DC组在C57BL/6小鼠脾细胞和胸腺细胞中,NKT细胞比例分别为:(15.46±2.63)%、(28.89±3.92)%;(38.41±3.91)%、(52.46±5.23)%。脾细胞中α-GalCer-loaded DC组较α-GalCer组具有明显的扩增效率(P=0.0315);胸腺细胞中,虽然α-GalCer-loaded DC组的扩增比例高于α-GalCer组,但无统计学意义(P>0.05)。免疫磁珠分选NKT细胞纯度高于90%。ELISA测定结果显示:α-GalCer-loaded DC较α-GalCer显着增加血清IL-4、IFNγ的分泌(P=0.0406,P=0.0129);α-GalCer + IL-2和α-GalCer + IL-2 + IL-7较α-GalCer明显增加培养上清中IL-4、IFNγ分泌,α-GalCer + IL-2 + IL-7和α-GalCer + IL-2比较无统计学意义(P>0.05)。结论:体外采用α-GalCer联合IL-2可有效扩增NKT细胞,加用IL-7可明显提高扩增效率。体内实施α-GalCer-loaded DC可显着扩增NKT细胞。体内外扩增活化的NKT细胞可分泌大量IL-4和IFNγ。目的:建立C57BL/B6→BALB/c小鼠清髓性异基因骨髓移植aGVHD模型。方法:25只SPF级BALB/c小鼠随机分为5组,各组小鼠分别接受7 Gy、7.5 Gy、8 Gy、8.5 Gy、9 Gy X射线全身照射(TBI)。20只BALB/c小鼠经预处理后随机分为4组,分别尾静脉输注1×106、2.5×106、5×106、10×106个骨髓细胞重建造血。在能重建造血的基础上建立aGVHD模型。为确定诱发不同程度aGVHD的脾细胞剂量,在输注骨髓细胞10×106基础上输注1×106、5×106、10×106个脾细胞,每个剂量组5只BALB/c小鼠。移植后观察aGVHD表现和生存率,2~3周取皮肤、肝脏、回肠进行病理组织学检查,3~4周进行嵌合度检测。结果:接受7 Gy剂量的小鼠,生存率为20%,中位生存期为22天;接受7.5 Gy、8 Gy、8.5 Gy、9 Gy剂量的小鼠全部死于造血衰竭,中位生存期分别为18、12、9、7天。四组生存时间采用Log-rank检验,χ2=18.85,P<0.0001。输注1×106、2.5×106骨髓细胞不能全部重建造血,60天生存率分别为40%和60%。输注5×106、10×106骨髓细胞可全部重建造血,60天生存率100%。四组生存时间采用Log-rank检验,χ2=6.78,P=0.0092。单纯输注骨髓细胞不能诱发aGVHD。低剂量脾细胞输注小鼠aGVHD程度轻,仅出现20% aGVHD相关死亡,中剂量和高剂量脾细胞输注小鼠均出现中重度aGVHD,一月内全部死亡(P<0.0001)。中重度aGVHD小鼠皮肤、肝脏和肠道可见明显的病理学改变。+28天脾细胞均达到完全供者嵌合体状态。结论: TBI 7.5 Gy以上对于BALB/c小鼠是致死性预处理。预处理后输注5×106以上骨髓细胞可全部重建造血。输注5×106以上脾细胞可诱发中重度aGVHD。确定8.5 Gy预处理,输注1×107骨髓细胞和5×106脾细胞建立清髓性异基因骨髓移植aGVHD模型。目的:探讨α-GalCer-loaded DC输注移植小鼠以扩增活化宿主残存Ⅰ型NKT细胞,观察其对小鼠异基因造血干细胞移植aGVHD的影响。另外,采用经α-GalCer-loaded DC体内扩增活化的宿主Ⅰ型NKT细胞输注,观察宿主NKT细胞过继免疫治疗对小鼠异基因造血干细胞移植aGVHD的抑制效应。方法:在C57BL/B6→BALB/c小鼠清髓性异基因骨髓移植aGVHD模型中,分组如下:(1)α-GalCer和α-GalCer-loaded DC组:①BMT对照组:BMCs 1×107;②GVHD对照组:BMCs 1×107 + SCs 5×106;③α-GalCer组:BMCs 1×107 + SCs 5×106 +α-GalCer(2μg/mouse);④α-GalCer-loaded DC1组:BMCs 1×107 + SCs 5×106 +α-GalCer-loaded DC(1×105);⑤α-GalCer-loaded DC2组:BMCs 1×107 + SCs 5×106 +α-GalCer-loaded DC(5×105)⑥α-GalCer-loaded DC3组:BMCs 1×107 + SCs 5×106 +α-GalCer-loaded DC(1×106)。(2)宿主NKT细胞输注组:①BMT对照组:BMCs 1×107;②GVHD对照组:BMCs 1×107 + SCs 5×106;③宿主NKT细胞输注1组:BMCs 1×107 + SCs 5×106 + NKT(5×105);④宿主NKT细胞输注2组:BMCs 1×107 + SCs 5×106 + NKT(1×106)。移植后采用临床GVHD积分评价各组小鼠aGVHD严重程度;病理组织学检查评价皮肤、肝脏、小肠的病理损伤;Log-rank检验各组生存率;ELISA法测定移植后第7天小鼠血清中的IL-4、IL-10、IFNγ、TNFα和CCL8水平。此外,模拟allo-BMT可能出现的体内异基因反应建立体外混合淋巴细胞反应(MLR)体系,观察实施α-GalCer-loaded DC和宿主NKT细胞输注对异源性供者T淋巴细胞增殖效应的影响。以C57BL/6供鼠来源的脾细胞(H2b)作为反应细胞,以丝裂霉素C去增殖的α-GalCer-loaded DC体内刺激的BALB/c受鼠脾细胞(H2d)(SCs stimulated by DC)、未经α-GalCer-loaded DC刺激的BALB/c受鼠脾细胞(H2d)(SCs without stimulation)和宿主NKT细胞(Host NKT cells)、宿主NKT阴性T细胞(Host NKT- T cells)作为刺激细胞,在不同浓度梯度下3H掺入法检测H2b脾细胞(反应细胞)的增殖效应。结果:骨髓移植对照组BALB/c小鼠不出现GVHD表现。GVHD对照组小鼠出现中到重度的aGVHD表现。α-GalCer组、α-GalCer-loaded DC1(1×105)组、α-GalCer-loaded DC2(5×105)组、宿主NKT细胞输注(5×105)1组和宿主NKT细胞输注(1×106)2组临床GVHD评分均低于GVHD对照组(P<0.05),其中,以α-GalCer-loaded DC2(5×105)组和宿主NKT细胞输注(1×106)2组减低最为明显;α-GalCer-loaded DC3(1×106)组则出现与GVHD对照组相似或加重的GVHD表现。GVHD对照组小鼠出现明显的皮肤、肝脏和肠道病理改变。α-GalCer-loaded DC(5×105)组和宿主NKT细胞输注组(1×106)小鼠aGVHD靶器官病理改变较GVHD对照组轻。移植后观察100天,GVHD对照组和α-GalCer-loaded DC(31×106)组小鼠1月内全部死亡。α-GalCer组(28.6%,2/7)、α-GalCer-loaded DC1(1×105)组(16.7%,1/6)、α-GalCer-loaded DC2(5×105)组(50.0%;4/8)较对照组显着提高生存率(P<0.0001);α-GalCer-loaded DC2(5×105)组较α-GalCer组和α-GalCer-loaded DC1(1×105)组能明显改善生存率(P=0.0243,P=0.0097)。宿主NKT细胞输注(5×105)1组(28.6%,2/7)和宿主NKT细胞输注(1×106)2组(37.5%;3/8)较对照组显着提高生存率(P<0.0001);二者相互比较生存率无统计学意义(P>0.05)。ELISA测定细胞因子结果显示:α-GalCer组和α-GalCer-loaded DC(5×105)组较GVHD对照组显着增加IL-4、IL-10的分泌(P<0.0001);α-GalCer-loaded DC(5×105)组IL-4的分泌较α-GalCer组明显增加(P=0.0176);IFNγ、TNFα在α-GalCer组、α-GalCer-loaded DC(5×105)组、GVHD对照组都呈现较高水平,无统计学意义(P>0.05);α-GalCer-loaded DC(1×106)组较α-GalCer-loaded DC(5×105)组IFNγ、TNFα分泌水平更高(P<0.05);宿主NKT细胞输注组(1×106)较GVHD对照组显着增加IL-4、IL-10的分泌(P<0.0001),而IFNγ明显减少(P=0.0361);CCL8在各组都明显增加,无统计学意义(P>0.05)。混合淋巴细胞反应结果显示,SCs stimulated by DC较SCs without stimulation能显着抑制H2b脾细胞的增殖反应,且抑制强度呈剂量依赖性(P<0.05)。异源性宿主NKT细胞对H2b反应细胞的增殖有显着抑制作用,且抑制强度呈剂量依赖性,而宿主NKT阴性T细胞则无抑制效应(P<0.01)。结论:小鼠异基因骨髓移植后实施适宜剂量的α-GalCer loaded DC和宿主Ⅰ型NKT细胞输注能显着抑制GVHD的病理进程、明显改善生存率,其机制主要是通过α-GalCer loaded DC刺激宿主残存NKT细胞的活化,NKT细胞分泌大量Th2型细胞因子,并抑制异源性T淋巴细胞的增殖活化而共同发挥作用。目的:采用经α-GalCer-loaded DC体内扩增活化的供者Ⅰ型NKT细胞输注,探讨供者NKT细胞过继免疫治疗对小鼠异基因造血干细胞移植aGVHD的免疫调控效应。方法:在C57BL/B6→BALB/c小鼠清髓性异基因骨髓移植aGVHD模型中,分组如下:①BMT对照组:BMCs 1×107;②GVHD对照组:BMCs 1×107 + SCs 5×106;③供者NKT细胞输注1组:BMCs 1×107 + SCs 5×106 + NKT(5×105);④供者NKT细胞输注2组:BMCs 1×107 + SCs 5×106 + NKT(1×106)。移植后采用临床GVHD积分评价各组小鼠aGVHD严重程度;病理组织学检查评价皮肤、肝脏、小肠的病理损伤;Log-rank检验各组生存率;ELISA法测定移植后第7天小鼠血清中的IL-4、IL-10、IFNγ、TNFα和CCL8水平。建立体外混合淋巴细胞反应(MLR)体系,以C57BL/6小鼠来源的脾细胞(H2b)作为反应细胞,以BALB/c小鼠来源的丝裂霉素C去增殖的脾细胞(H2d)作为刺激细胞,并在该MLR体系中加入不同数量的去增殖C57BL/6供鼠(H2b)来源的分选NKT细胞(Donor NKT cells)、NKT阴性T细胞(Donor NKT- T cells)。3H掺入法检测H2b脾细胞(反应细胞)的增殖效应。结果:骨髓移植对照组BALB/c小鼠不出现GVHD表现。GVHD对照组小鼠出现中到重度的GVHD表现。供者NKT细胞输注1组(5×105)和2组(1×106)GVHD临床评分低于GVHD对照组(P<0.05)。供者NKT细胞输注组(1×106)小鼠皮肤、肝脏和肠道病理改变较GVHD对照组减轻。移植后观察100天, GVHD对照组小鼠1月内全部死亡。供者NKT细胞输注1组(5×105)和2组(1×106)较GVHD对照组显着提高生存率(P<0.0001);供者NKT细胞输注2组(1×106)生存率(42.9%,3/7)高于NKT细胞输注1组(5×105)(25.0%,2/8)(P=0.0375)。ELISA测定细胞因子结果显示:供者NKT细胞输注组(1×106)较GVHD对照组显着增加IL-4、IL-10的分泌(P<0.0001);IFNγ、TNFα、CCL8在供者NKT细胞输注组和GVHD对照组无统计学意义(P>0.05)。混合淋巴细胞反应结果显示,在加入2×105时,供者NKT细胞较NKT阴性T细胞对H2b反应细胞的增殖具有明显抑制作用(P=0.0382)结论:小鼠异基因骨髓移植后实施α-GalCer-loaded DC体内扩增活化的供者Ⅰ型NKT细胞输注可明显改善aGVHD的临床表现和病理改变、显着提高生存率,其机制主要是通过促进Th2型细胞因子的分泌和抑制供者T淋巴细胞的增殖活化而产生aGVHD抑制作用。目的:观察异基因造血干细胞移植患者Vα24+Vβ11+ NKT细胞的重建及移植物和外周血NKT细胞数量对aGVHD的影响。方法:2010年5月至2010年10月在苏州大学附属第一医院血液科接受异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的38例患者中,男性20例、女性18例,中位年龄3(313~55)岁。实施同胞全相合骨髓移植(MSD-BMT)患者20例,同胞全相合外周血干细胞移植(MSD-PBSCT)患者4例,无关供者全相合外周血干细胞移植(MUD-PBSCT)11例,单倍型骨髓移植(HID-BMT)3例。取骨髓和外周干细胞的移植物、移植患者+30、+60、+90天及aGVHD发生时的外周抗凝血,分离MNC以APC-CD3、PE-TCRVα24、FITC-TCRVβ11单抗进行叁色标记,流式细胞术检测Vα24+Vβ11+ NKT细胞比例。分析发生aGVHD和未发生aGVHD患者的移植物和外周血NKT细胞数量对aGVHD的影响。结果:38例allo-HSCT患者均获得造血重建。aGVHD总发生率63%,其中Ⅰ~Ⅰ度50%,Ⅲ~Ⅲ度13%。+30、+60、+90天外周血NKT细胞比例分别为:BMT组(0.37±0.10)%、(0.34±0.09)%、(0.48±0.16)%,PBSCT组(0.33±0.07)%、(0.63±0.19)%、(0.55±0.15)%。PBSCT组在+60天明显高于BMT组(P=0.0462)。MSD-BMT中,发生aGVHD和未发生aGVHD患者输注NKT细胞数量和外周NKT细胞数量分别为(0.33±0.06)×106/kg、(0.40±0.10)×106/kg(P>0.05)和(0.9±0.18)×106/L、(1.1±0.25)×106/L(P>0.05)。MUD-PBSCT中,发生aGVHD和未发生aGVHD患者输注NKT细胞数量和外周NKT细胞数量分别为(0.29±0.07)×106/kg、(0.26±0.09)×106/kg(P>0.05)和(1.2±0.24)×106/L、(1.0±0.21)×106/L(P>0.05)。表明移植物和外周血中NKT细胞的绝对数量不影响aGVHD的发生和程度。结论:异基因造血干细胞移植患者NKT细胞的重建骨髓移植慢于外周血干细胞移植,输注NKT细胞数量和外周血NKT细胞数量不影响aGVHD的发生和严重程度。
参考文献：
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