口蹄疫多表位靶向疫苗的构建及黏膜免疫效果

论文摘要

口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的急性、热性、高度接触性传染病,主要侵害猪、牛、羊等家畜和其它野生偶蹄动物。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。世界动物卫生组织（OIE）将FMD列为动物A类烈性传染病,严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易,对国家的政治、经济具有深远的影响。黏膜作为机体与外界连通的门户,对于FMDV的侵入有很大的助力作用。微皱褶细胞（Microfold cell,简称M细胞）是黏膜免疫反应中摄取抗原的第一个细胞,是黏膜相关淋巴组织的初始效应位点。摄取抗原是诱导免疫反应最关键的一步。所以M细胞在病原微生物从呼吸道入侵和黏膜免疫呈递抗原中均发挥重要的作用。本研究成功构建了两株重组乳酸乳球菌,分别命名为NZ9000/pNZ8148-TB1和NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1。利用乳酸乳球菌表达（NICE）系统表达目的蛋白TB1和TB1-Co1,研究重组乳酸乳球菌的免疫效果以及靶向M细胞的可行性,为口蹄疫新型疫苗的研发和口蹄疫的防治提供新途径。本研究的主要内容如下:1.TB1和TB1-Co1的合成及其生物信息学分析:根据乳酸乳球菌密码子的偏好性对多表位TB1和TB1-Co1的编码基因进行优化合成,连接到克隆载体pUC57上。通过生物信息学得到多表位TB1和TB1-Co1具有作为良好抗原的潜力,对进一步的研究打下理论基础。2.目的蛋白在乳酸乳球菌中的表达及鉴定:将目的基因片段TB1和TB1-Co1连接到表达载体pNZ8148上,得到重组质粒pNZ8148-TB1和pNZ8148-TB1-Co1,电转化到乳酸乳球菌NZ9000中,通过质粒提取、双酶切鉴定、测序分析筛选出阳性重组乳酸乳球菌,得到重组菌NZ9000/pNZ8148-TB1和NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1。使用诱导剂nisin诱导目的蛋白表达,并对表达条件进行优化。Western blot检测可见目的条带,表明目的蛋白在乳酸乳球菌NZ9000中得到表达。3.重组乳酸乳球菌（NZ9000/pNZ8148-TB1和NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1）黏膜免疫效果分析:用重组乳酸乳球菌经灌胃免疫小鼠,进行免疫原性分析,其中PBS作为空白对照,NZ9000/pNZ8148作为空载体对照,灭活苗作为阳性对照组。结果显示,实验组肠道黏液中sIgA水平明显高于阴性对照组和空载体对照组,但血清内特异性IgG抗体效价比较低;实验组小鼠淋巴细胞中CD4+细胞和CD8+细胞的比值高于阴性对照组;小鼠脾淋巴细胞在抗原刺激后增殖明显;细胞因子检测结果表明,与阴性对照组相比,实验组的IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ的量都有不同程度的增高,以上结果表明,重组乳酸乳球菌作为口服活载体疫苗可以诱导小鼠产生FMDV特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。4.靶向实验:用诱导的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-TB1-Co1和NZ9000/pNZ8148-TB1接种小鼠,获取小鼠小肠组织做成石蜡切片,经荧光染色后用激光共聚焦显微镜观察。结果表明,前者的红色荧光和绿色荧光的结合较多。这表明Co1对M细胞具有靶向作用,可增强机体的免疫应答。

论文目录

摘要

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英文缩略表

第一章引言

1.1 黏膜免疫

1.1.1 黏膜免疫系统

1.1.2 黏膜免疫的优势

1.1.3 黏膜屏障和黏膜免疫的关系

1.1.4 黏膜免疫的机制

1.1.5 黏膜免疫靶向疫苗的设计策略

1.2 乳酸乳球菌表达系统

1.2.1 宿主菌

1.2.2 乳链菌肽

1.2.3 nisin控制的基因表达系统

1.3 研究目的及意义

1.3.1 研究目的

1.3.2 研究意义

第二章多表位基因的合成及其生物信息学分析

2.1 多表位TB1和TB1-Co1 的合成

2.2 生物信息学分析

2.3 实验结果

2.3.1 基本理化性质分析

2.3.2 跨膜区分析

2.3.3 抗原性分析

2.3.4 目的蛋白二级结构分析

2.3.5 目的蛋白三级结构预测

2.4 讨论

第三章 A型 FMDV多表位基因在乳酸乳球菌中的表达

3.1 材料

3.1.1 菌株

3.1.2 主要试剂

3.1.3 培养基及主要试剂的配制

3.1.4 主要实验仪器

3.2 方法

3.2.1 目的基因设计与合成

3.2.2 重组表达载体的构建

3.2.5 重组表达质粒的鉴定

3.2.6 蛋白的诱导表达及鉴定

3.3 结果

3.3.1 多表位TB1和TB1-Co1 基因的密码子优化

3.3.2 重组表达质粒的鉴定

3.3.3 重组乳酸乳球菌的SDS-PAGE结果

3.3.4 重组乳酸乳球菌的Western blot结果

3.4 讨论

第四章重组乳酸乳球菌黏膜免疫效果的评估

4.1 材料

4.1.1 菌株和实验动物

4.1.2 主要试剂

4.1.3 主要实验仪器

4.2 方法

4.2.1 小鼠分组及免疫

4.2.2 黏膜样品中sIgA的检测

4.2.3 血液中IgG、IgA的检测

+、CD8⁺T 细胞亚群的检测'> 4.2.4 外周血CD4⁺、CD8⁺T 细胞亚群的检测

4.2.5 脾淋巴细胞增殖试验

4.2.6 细胞因子的检测

4.2.7 靶向M细胞的效果验证

4.2.8 数据分析

4.3 实验结果

4.3.1 黏膜样品中sIgA的检测结果

4.3.2 血液中IgG、IgA的检测

+、CD8⁺T细胞亚群的检测结果'> 4.3.3 外周血CD4⁺、CD8⁺T细胞亚群的检测结果

4.3.4 脾淋巴细胞增殖试验结果

4.3.5 细胞因子的检测结果

4.3.6 靶向M细胞的效果验证结果

4.4 讨论

第五章全文总结

参考文献

附录

致谢

作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张富东

导师: 潘丽

关键词: 口蹄疫病毒,乳酸乳球菌,靶向,黏膜免疫

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: 十三五国家重点研发项目(编号:2017YFD0501300),国家自然科学基金面上项目(编号:3177130924)

分类号: S852.4

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