Elp3在酿酒酵母氧化应激反应中的功能研究

论文摘要

Elp3具有组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase,HAT）活性,是Elongator复合物的催化亚基,可乙酰化组蛋白H3和H4上特定位点的氨基酸。本实验室前期研究发现,Elp3缺失及其HAT靶位点H3K14/H4K8突变使elp3△酵母H2O2敏感性增强,表明Elp3可能通过乙酰化组蛋白促进抗氧化基因的转录进而影响酿酒酵母的H2O2耐受性。为进一步验证该推测,我们以WT、elp3△菌株为对照,对含Elp3全长及其保守HAT或SAM结构域缺失的H3/H4野生及突变elp3△转化株中ROS、MDA和CAT、SOD、GPX基因mRNA水平进行测定。结果发现H2O2胁迫下,各菌株ROS、MDA含量都明显升高,转入yELP3基因能降低elp3△细胞内ROS、MDA水平;H3K14/H4K8突变使elp3△菌株ROS、MDA水平进一步升高,yELP3的补偿作用降低。qRT-PCR检测结果表明,氧化胁迫下elp3△菌株中CAT、SOD、GPX基因表达量明显低于WT,而转入yELP3会使elp3△菌株中这些抗氧化基因表达水平增加。在H3K14/H4K8突变的elp3△转化株中,抗氧化基因的表达量进一步下调,yELP3的补偿作用也明显降低。上述结果表明Elp3可通过乙酰化组蛋白调控抗氧化基因的转录,参与酿酒酵母的氧化应激反应。此外Elp3两保守HAT或SAM结构域任何一个缺失都会降低ELP3对elp3△菌株的补偿作用,其ROS、MDA及抗氧化基因水平与elp3△菌株相似,表明HAT和SAM结构域对Elp3功能的发挥很重要。已知Elp3还可以修饰tRNA,影响蛋白的翻译效率。因此,Elp3很可能也通过tRNA修饰功能参与酵母的氧化应激。我们以WT、elp3△及tRNALysys UUU和tRNAGlnUUG单独或同时过表达的elp3△菌株为材料,H2O2胁迫下对这些菌株进行敏感性检测和抗氧化指标测定。结果发现tRNALysUUU和tRNAGlnUUG同时过表达能显著提高elp3△菌株的H2O2耐受性,降低ROS、MDA水平。表明Elp3可能通过其tRNA修饰影响一些抗氧化酶的翻译效率进而影响细胞H2O2耐受性。接下来我们通过Western Blot测定一些抗氧化蛋白的表达量,结果发现H2O2胁迫下,tRNALysUUU/tRNAGlnUUG/elp3△菌株的总蛋白含量、SOD、GPX3、CAT蛋白水平均介于elp3△菌株和WT之间。这些结果表明修饰tRNA过表达对H2O2胁迫下elp3△细胞抗氧化蛋白的表达降低,ROS、MDA升高及H2O2耐受性降低等均有明显的补偿改善功能。揭示Elp3可通过对tRNA修饰影响抗氧化蛋白的翻译而参与酿酒酵母的氧化应激反应。酵母氧化应激和热激反应有着一定的联系。通过对WT、elp3△及tRNALysUUU和tRNAGlnUUG单独或同时过表达的elp3△菌株中氧化应激相关指标的测定,结果发现高温和H2O2协同处理会进一步降低elp3△菌株的H2O2耐受性,修饰tRNA过表达对elp3△菌株的H2O2和高温敏感表型有明显的补偿作用。而且H2O2胁迫条件下Elp3缺失使得细胞Hsp75、Hsp105蛋白表达明显下调。这些结果表明H2O2胁迫下,Elp3可通过调控一些氧化应激相关蛋白和热激蛋白等的表达进而影响细胞氧化应激。

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摘要

ABSTRACT

第一章引言

1.1 Elp3 相关研究进展

1.1.1 Elongator复合物的发现及结构特征

1.1.2 Elp3 的结构与功能

1.2 酿酒酵母的氧化应激反应

1.2.1 活性氧与氧化应激

1.2.2 酵母氧化应激反应的抗氧化防御体系

1.2.3 酵母氧化应激主要转录激活因子

1.3 热激与氧化应激之间的相互作用

1.3.1 酵母热激反应和相关转录因子

1.3.2 酿酒酵母氧化应激与热激之间的关系

1.4 研究目的和意义

第二章材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 酵母菌株

2.1.2 引物设计

2.1.3 主要试剂

2.1.4 酵母培养基

2.1.5 试剂盒和抗体

2.1.6 主要仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 ROS水平的测定

2.2.2 MDA的测定

2.2.3 基因表达分析

2.2.4敏感性实验

2.2.5 生长曲线

2.2.6 细胞总蛋白的提取

2.2.7 Western Blot

第三章结果和分析

3.1 Elp3的HAT活性对酵母氧化应激反应的影响

3.1.1 Elp3 缺失及HAT靶位点突变对ROS的影响

3.1.2 Elp3 缺失及HAT靶位点突变对MDA的影响

3.1.3 Elp3 缺失及HAT靶位点突变对抗氧化基因表达的影响

3.2 Elp3的t RNA修饰作用对酿酒酵母氧化应激反应的影响

3.2.1 Elp3 缺失及修饰t RNA过表达菌株敏感性实验

3.2.2 Elp3 缺失及修饰t RNA过表达菌株的生长曲线

3.2.3 Elp3 缺失及修饰t RNA过表达对细胞ROS影响

3.2.4 Elp3 缺失及修饰t RNA过表达对细胞MDA的影响

3.2.5 Elp3 缺失及修饰t RNA过表达对细胞总蛋白的影响

3.2.6 Elp3 缺失及修饰tRNA过表达对抗氧化蛋白表达的影响

3.2.7 Elp3 缺失及修饰t RNA过表达对热激蛋白表达的影响

第四章讨论

4.1 Elp3 通过转录调控参与酿酒酵母氧化应激

4.2 Elp3 对酿酒酵母氧化应激的翻译调控

4.3 Elp3 两保守结构域在氧化应激反应中的功能地位

4.4 Elp3 与酿酒酵母热激反应

第五章结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 童文艳

导师: 李芬

关键词: 基因表达,修饰,蛋白翻译,氧化应激

来源: 河南师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 河南师范大学

分类号: Q933

DOI: 10.27118/d.cnki.ghesu.2019.000343

总页数: 71

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Elp3在酿酒酵母氧化应激反应中的功能研究

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