晏建国[1]2016年在《叁氧化二砷对急性早幼粒细胞白血病细胞WNT信号通路抑制基因（HDPR1、WIF-1、DKK3）组蛋白和DNA甲基化修饰调控及其机制研究》文中研究说明目的:本研究主要是选择急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)细胞株NB4细胞中异常高甲基化的WNT信号通路抑制基因WIF-1、DDK3、HDPR1基因为靶点,从表观遗传学的DNA甲基化和组蛋白甲基化修饰两个方面,探讨叁氧化二砷(arsenic trioxide,As203)治急性早幼粒细胞白血病(APL)可能的表观遗传学机制;通过对As203作用NB4细胞前后DNA甲基转移酶、组蛋白甲基化酶、组蛋白去甲基化酶表达差异的检测,分析叁氧化二砷调控DNA和组蛋白甲基化可能的作用机理;并通过对As203作用NB4细胞前后β-catenin、Survivin基因、cyclin-D1基因以及C-myc基因表达差异的检测,进一步分析叁氧化二砷对WNT信号通路下游重要靶基因表达影响;从而比较完整的从DNA甲基化和组蛋白甲基化的表观遗传学层面阐释叁氧化二砷影响NB4细胞WNT/β-catenin信号通路发挥抗APL作用的可能机制。方法:1.采用CCK-8法检测As203对急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4细胞存活率的影响;Annexin V FITC/PI流式细胞仪检测As203作用NB4细胞前后凋亡率;流式细胞仪检测As203作用NB4细胞前后细胞周期百分率;采用重亚硫酸盐测序聚合酶链反应(bisulfite sequencing polymerase chain reaction BSP)联合TA克隆测序方法,定量分析不同实验组叁氧化二砷作用前后NB4细胞株其WNT信号通路抑制基因WIF-1、DDK3、HDPR1基因DNA启动子区甲基化水平的变化,并通过与MSP、焦磷酸测序相比,探讨BSP优缺点;2.采用染色质免疫共沉淀(chromatin immunopreciprtation assay CHIP)技术检测As203作用NB4细胞前后WIF-1、DDK3、HDPR1基因启动子区组蛋白H3K9单甲基化、二甲基化和叁甲基化的水平;采用荧光实时定量PCR法(q RT PCR)检测As203作用NB4细胞前后DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B,H3K9组蛋白甲基转移酶SUV39a、G9a,H3K9组蛋白去甲基化转移酶JMJD2A、JMJD2B、JMJD2C和JMJD2D,进一步探讨叁氧化二砷对NB4细胞WNT通路抑制基因组蛋白H3K9甲基化和DNA甲基化影响的可能的机制。3.采用荧光实时定量PCR法(q RT PCR)检测As203作用NB4细胞前后WNT/β-catenin信号通路抑制基因WIF-1、DDK3、HDPR1基因,WNT信号转导通路重要调节蛋白β-catenin以及WNT信号通路下游重要靶基因Survivin、cyclin-D1和C-myc m RNA的表达,比较完整的从组蛋白甲基化和DNA甲基化的表观遗传学层面阐释As203影响NB4细胞WNT/β-catenin信号通路发挥抗APL作用的可能机制。结果:1.不同浓度As203作用NB4的细胞后,NB4细胞增殖抑制率随时间和浓度增加而显着升高;细胞凋亡比例也逐渐增加,24 h、48 h以早期凋亡为主,72h细胞以中晚期凋亡为主;细胞周期24 h、48 h以G2/M期增加的较为明显,72 h有轻度的G0/G1期增加。2.经过BSP联合TA克隆测序方法检测发现,As203处理NB4细胞后,随着药物浓度的增加,作用时间的延长,WIF-1、DDK3、HDPR1基因甲基化率进行性下降,甲基化程度明显减弱。通过与MSP、焦磷酸测序相比,用BSP具有较高的甲基化状态检出率,且方法较为简单,重复性较强,能准确检测目的基因片段中各Cp G位点的甲基化情况,对分析Wnt信号通路抑制基因甲基化状态具有较高的特异性和敏感性。3.经过q RT PCR检测发现,As203处理NB4细胞后,As203处理NB4细胞前后,随着药物浓度的增加,作用时间的延长,HDPR1基因的m RNA相对表达量呈上调趋势,甲基转移酶DNMTl、DNMT3A、DNMT3B的表达呈下降趋势。4.采用CHIP检测发现,As203处理NB4的细胞后,随着药物浓度的增加,作用时间的延长,WIF-1、DDK3和HDPR1基因启动子区的组蛋白H3K9me3均有不同程度的下降,以HDPR1基因明显;而H3K9me1,2表达不受影响。经过q RT PCR检测发现,As203作用NB4细胞后,随着浓度的增加,作用时间延长,H3K9组蛋白甲基转移酶SUV39a、G9a的m RNA相对表达量呈下调趋势,其中G9a m RNA的下调更为明显;同时H3K9组蛋白去甲基化转移酶JMJD2D m RNA的表达上调,而JMJD2A、JMJD2B、JMJD2C表达不受影响。5.经过q RT-PCR检测发现,As203作用NB4细胞后,随着药物浓度的增加,干预时间的延长,β-catenin表达水平明显下调,同时,survivin、c-myc和cyclin-D1表达也随之下降,与未处理组细胞相比差异有统计学意义。结论:1.As203能够明显的抑制急性早幼粒细胞白血病NB4细胞的生长和增殖,随着药物浓度的增加,作用时间的延长,细胞凋亡率随之逐渐增加,而且使细胞周期阻滞于G2/M期;2.As2O3能逆转急性早幼粒细胞白血病NB4细胞WIF-1、DKK3、HDPR1基因启动子区的DNA异常高甲基化和下调WIF-1、DKK3、HDPR1基因启动子区的H3K9 me3甲基化水平而使表达受抑的肿瘤抑制基因WIF-1、DKK3、HDPR恢复表达;3.BSP具有较高的甲基化状态检出率,且方法较为简单,重复性较强,能准确检测目的基因片段中各Cp G位点的甲基化情况,对分析Wnt信号通路抑制基因甲基化状态具有较高的特异性和敏感性,可广泛应用于筛选不同类型标本基因启动子甲基化分析;4.As203可能通过抑制组蛋白甲基化酶SUV39a和G9a和DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达来逆转组蛋白和DNA的高甲基化;5.As203通过下调组蛋白和DNA甲基化基础上,可能通过组蛋白-DNA循环反馈机制,进一步下调组蛋白和DNA甲基化水平;6.通过下调组蛋白甲基化酶SUV39h1的表达来减少PML-RARa/SUV39h1复合物形成,抑制H3K9甲基化,促进基因转录表达,促进血细胞分化。7.通过下调DNA甲基转移酶DNMT1和组蛋白甲基化酶G9a的表达来减少DNMT1-UHRF1-G9a复合体形成,抑制H3K9甲基化,促进基因转录表达。8.As203处理NB4细胞后,随着药物浓度的增加,干预时间的延长,c-myc和cyclin-D1表达水平明显下调,其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。
乔淑凯[2]2003年在《急性白血病患者DNA甲基转移酶基因的表达及其临床意义》文中研究指明目的：急性白血病是血液系统最常见的恶性肿瘤之一，在白血病细胞株和白血病患者中均发现有DNA的异常甲基化，并可能是引起白血病发生、发展的重要因素。DNA甲基化修饰由DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMTs）催化完成，使甲基连接到胞嘧啶的C5位置上，通常这一反应发生在5’-CG-3’序列，即所谓的CpG二核苷酸上，它是真核动物最常见的DNA修饰方式，它可以在不改变核苷酸序列的基础上改变基因的表达。因此，DNA甲基转移酶基因可以通过改变靶基因启动子区域内富含CpG序列（CpG岛）的甲基化状态，使其转录水平发生变化。近年来，人们研究发现DNA甲基转移酶参与基因的表达调控、胚胎发育、基因组印记和X-染色体失活等诸多重要的生物学过程，并与许多肿瘤疾病密切相关，在肿瘤细胞中，基因组DNA的总体甲基化水平比正常细胞低，但却伴有某些CpG岛甲基化程度增高，癌基因的广泛去甲基化和抑癌基因启动子区域的过甲基化均可影响肿瘤的发生、发展过程。在国外有研究证实，在白血病细胞中，有众多的基因处于异常甲基化状态，即包括癌基因的广泛去甲基化，也包括抑癌基因启动子区域的过甲基化。特别是后者，可能是导致白血病发生重要的原因之一。本研究制旨在探讨DNMTs基因在急性白血病患者中的表<WP=5>达及其与临床预后之间的关系。同时进一步了解甲基化抑制剂对白血病细胞恶性克隆生长抑制的影响及其作用机制，为临床治疗白血病提供帮助。方法：本研究对象为72例成人急性白血病（acute leukemia，AL）患者，其中急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）54例，急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）18例。正常健康人20例作为对照。采用半定量逆转录－聚合酶链反应（simi-quantify reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）方法对AL患者和20例正常对照的骨髓进行DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、P15、MDR1、PCNA mRNA水平的检测。采用甲基化特异性PCR（MSP-PCR）方法检测56例AL患者和14例正常对照P15基因启动子区域CpG岛甲基化率。通过细胞培养的方法对白血病细胞株K562、HL-60以及原代细胞进行传代培养，并用不同浓度的甲基化抑制剂5杂氮－2脱氧－胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-CdR）对其进行处理，然后于镜下观察细胞增殖状况；用MTT法观察细胞活性及生长状况，并绘制生长曲线；用NBT还原实验观察HL-60细胞的分化情况；用Wright－Giemsa染色对各种细胞进行形态学观察；用DNA凝胶电泳观察细胞凋亡情况；用RT-PCR方法检测实验组与对照组DNMTs、P15、P53、Bcl－2的mRNA水平；用MSP-PCR方法检测原代细胞P15基因CpG岛在实验组和对照组的甲基化状况。结果：1. AL患者组所有叁种DNMTs表达均明显高于对照组<WP=6>（P<0.01），改用增殖细胞核抗原（PCNA）作为内对照，差别仍具有统计学意义（P<0.01），对于DNMT3B来说，差别反而更明显，说明DNMTs在AL患者的高表达与细胞增殖程度无关。2. AL患者叁种DNMTs基因表达之间呈明显正相关，表现为协同的高表达；而P15、MDR1与DNMTs表达则呈明显负相关，P15与MDR1之间表达无相关性。3. DNMTs基因同时阳性患者组，完全缓解率为74.5％；DNMTs基因部分阳性或阴性患者组，完全缓解率为23.8％，两者有明显差异（P<0.01），特别是在3例DNMTs同时阴性的白血病患者，首次诱导化疗无一例缓解。4. 在56例AL患者中，31例（55.4%）有P15基因启动子区域CpG岛完全甲基化，12例（21.4％）有P15基因部分甲基化，14例正常对照在同一实验条件下P15基因无一被甲基化，分组分析P15基因甲基化组与未甲基化组的DNMTs mRNA表达水平，发现甲基化组明显高于未甲基化组（P<0.01）。5. 甲基化抑制剂5-aza-CdR对HL-60、K562细胞株和白血病原代细胞的生长均有明显抑制作用，并存在有明显的剂量依赖性和时间依赖性的量效关系。6. 在0.5 umol/L 浓度下，5-aza-CdR对HL-60细胞的分化有明显的诱导作用，但在此浓度下，对原代细胞的诱导分化作用不明显，在高浓度5-aza-CdR作用下，各种白血病细胞均表现出明显的毒性作用。7. 在5-aza-CdR处理后，细胞形态发生类似变化，表现为染色质凝聚，核固缩破裂，有些出现凋亡小体，在<WP=7>5.0umol/L浓度下，部分细胞胞浆中空泡增多，并可见到细胞核与核膜溶解，核结构不清的退化细胞。8. DNA凝胶电泳显示，在5-aza-CdR处理后，细胞发生了不同程度的凋亡，以2.0 umol/L及5.0 umol/L最为明显，与对照组相比出现了明显的DNA梯形条带，但在低浓度5-aza-CdR组，DNA梯形条带形成不明显。9. RT-PCR结果显示，与对照组相比，各试验组细胞有明显的P15 mRNA和P53 mRNA表达上调以及Bcl-2 mRNA表达下调，并且表达强度与药物浓度有剂量依赖关系，但DNMTs mRNA在各组间的表达水平则无明显差别。10.MSP-PCR结果显示，在原代细胞中，随着5-aza-CdR浓度的增加，其P15基因甲基化状态逐渐变低，在5.0 umol/L浓度下时，P15变为未甲基化状态。结论：1. DNMTs基因在成人AL有异常高表达，其可能通过促使抑癌基因启动子区域过甲基化，而使其转录失活，从而导致白血病恶性克隆的形?
乔淑凯, 徐世荣, 郭晓楠, 王颖[3]2005年在《急性白血病患者DNA甲基转移酶基因的表达其及临床意义》文中研究指明为了探讨DNA甲基转移酶(DNMT)基因在成人急性白血病(AL)患者中的表达及其与临床预后之间的 关系,对72例AL患者和20例正常人的骨髓采用RT-PCR方法进行DNMT、p15INK4B、mdrl mRNA水平的检测;对 56例AL患者和14例正常人p15INK4B基因启动子区域CpG岛甲基化率,采用甲基化特异性PCR方法进行检测。结 果表明:AL患者组所有3种DNMT表达均明显高于对照组(P<0.01),改用细胞增殖核抗原(PCNA)为内对照, 差别仍有统计学意义。AL患者3种DNMT基因表达之间呈明显正相关,表现为协同的高表达;p15INK4B、mdrl与 DNMT表达呈明显负相关。DNMT因同时阳性患者组完全缓解(CR)率明显高于DNMT基因部分阳性或阴性 患者组(P<0.01)。p15INK4B基因在56例AL患者中,31例(55.4％)完全甲基化,12例(21.4％)部分甲基化,14例 正常人在同一条件下则无1例甲基化。结论:DNMT基因在成人AL患者有异常高表达,其可能通过促使抑癌基因 启动子区域过甲基化,而使其转录失活,从而导致白血病恶性克隆的形成。对于高表达DNMT的AL患者,可能对 化疗更敏感,提示DNMT基因高表达可能是临床预后较好的指标。
吴淡森[4]2013年在《p15-piRNAs介导白血病细胞p15~(INK4b)基因DNA与组蛋白甲基化修饰机制研究》文中提出目的：本文探讨新型非编码RNA分子——piRNAs介导白血病细胞p15~(INK4b)基因甲基化修饰和/或异染色质形成的可能机制，为白血病发生、发展提供新的方向。方法：首先，采用荧光定量PCR与Western Blotting方法检测p15~(INK4b)基因在急性白血病患者中的表达水平，同时应用基因甲基化检测技术检测p15~(INK4b)基因启动子区CpG岛的甲基化水平，染色质免疫共沉淀技术分析p15~(INK4b)基因启动子区异染色质水平，分析DNA甲基化和/或异染色质水平的临床意义；其次，采用荧光定量PCR检测p15-piRNAs分子表达水平，利用RNA免疫共沉淀技术鉴定Piwi亚家族AGO3蛋白与p15-piRNAs分子的结合水平，蛋白质免疫共沉淀技术鉴定piRNA-Piwi通路组件及其成分；最后，采用诱导细胞系过表达p15-piRNAs分子，分析其对基因表达、DNA甲基化和异染色质等的影响。结果：（1）急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患者p15~(INK4b)基因的表达水平较正常人和急性髓细胞白血病（acute myelocytic leukemia，AML）患者明显减低（RQ=0.08±0.06， p=0.00<0.05）；甲基化特异性PCR（Methylation-specific PCR，MSP）检测ALL患者基因甲基化的阳性率为100%，而AML患者为42.9%，差别具有统计学意义（P=0.016<0.05）；在细胞系Molt-4中p15~(INK4b)基因启动子区CpG岛中45个CG位点发生了高甲基化修饰，细胞系U937则无发生甲基化；在Molt-4中p15~(INK4b)基因启动子区的组蛋白H3K9发生了单甲基化和双甲基化修饰（P≤0.05），相反在细胞系U937中该基因组区域的组蛋白H3K9和H3K27无发生甲基化修饰（P>0.05）；（2）hsa_piR_014637、hsa_piR_011186分子在细胞系Molt-4和U937中存在差异性表达，细胞系Molt-4的相对表达水平较高，且以hsa_piR_011186分子较明显（p=0.003<0.05）。在细胞系Molt-4中，两个p15-piRNAs分子与AGO3蛋白的相互作用程度高于细胞系U937，以hsa_piR_011186分子为明显（p≤0.05）；细胞系Molt-4和U937均存在piRNA-AGO3通路组件，组成成分存在着差异性；在细胞系Molt-4中通路组件含有Suv39H1、EZH2、DNMT3a和DNMT3b等蛋白，不具有DNMT1蛋白；在细胞系U937中通路组件同样含有Suv39H1和EZH2蛋白，但含量低于细胞系Molt-4，且Suv39H1的含量较EZH2蛋白低，另外该组件不含DNMT3a和DNMT3b蛋白，而含有DNMT1蛋白；（3） U937转染细胞分别过表达hsa_piR_014637和hsa_piR_011186分子，两者的表达水平无差别（p=0.80>0.05），但是两者与AGO3蛋白的结合水平存在着差异性（p=0.002<0.05），hsa_piR_011186转染组的结合水平相当较高；U937转染细胞出现p15~(INK4b)基因表达明显下调，以hsa_piR_011186转染组为明显（p=0.00<0.05）； hsa_piR_011186转染组的p15~(INK4b)基因启动子区DNA发生了甲基化修饰，而其它组无发生甲基化；相对于阴性对照组，hsa_piR_014637和hsa_piR_011186转染组的p15~(INK4b)基因启动子区组蛋白H3均发生不同程度的甲基化修饰改变（p≤0.05），hsa_piR_011186转染组的组蛋白H3甲基化修饰程度较为明显（p≤0.05），以H3K27的双甲基化修饰为明显（p≤0.05）。结论:不同类型白血病细胞存在p15-piRNAs分子的差异性表达，并存在由不同的表观遗传调控分子组成的piRNAs-Piwi通路组件，该组件含有通过piRNAs分子的序列互补性，特异性地定位结合于p15~(INK4b)基因组上，表观遗传调控分子催化基因启动子区DNA和/或组蛋白H3发生甲基化修饰，进而调控基因表达。
钟雯婷[5]2011年在《RYBP、BMI1及LSD1蛋白在急性白血病中表达情况的研究》文中研究说明目的:观察PcG蛋白RYBP(Ring1 and YY1-binding protein,RYBP)、BMI1(B-cell specific moloney leukemia virusinsertion site 1)蛋白及组蛋白去甲基化酶LSD1(Lysine specific demethylase 1)在急性白血病中的表达状况,初步探索它们在急性白血病中表达的临床意义。方法:应用蛋白质免疫印迹(western blot)技术,分别检测急性单核细胞白血病细胞株SHI-1、急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60、慢性粒细胞白血病细胞株K562及初治急性白血病(AL)、急性白血病化疗后达完全缓解(ALCR)患者和对照(非恶性血液病)患者的骨髓单个核细胞(BM-MNCs)中RYBP、BMI1及LSD1蛋白的表达情况,初步分析它们在急性白血病中的表达规律及临床意义。结果:1. RYBP表达情况:SHI-1、HL-60及K562细胞株RYBP表达均为强阳性;21例非恶性血液病对照中RYBP表达阴性。AL组的RYBP表达阳性率为72.5%,ALCR组阳性率为13%,AL组的RYBP表达阳性率及表达量比ALCR组及对照组明显增高(P<0.05);其中初治的急性髓系白血病(AML)组和急性淋巴细胞白血病(ALL)组RYBP表达阳性率及表达量均明显高于对照组(P<0.05),而AML和ALL两组间的RYBP表达阳性率及表达量无显着差异(P>0.05)。2. BMI1表达情况:SHI-1、HL-60及K562细胞株BMI1蛋白表达均为强阳性;8例非恶性血液病对照及24例ALCR组中BMI1蛋白表达阴性。AL组的BMI1蛋白表达阳性率为61.0%。AL组的BMI1蛋白表达阳性率及表达量比ALCR组及对照组明显增高(P<0.05);其中初治的急性髓系白血病(AML)组和急性淋巴细胞白血病(ALL)组BMI1蛋白表达阳性率及表达量均明显高于对照组(P<0.05),而AML和ALL两组间的BMI1蛋白表达阳性率及表达量无显着差异(P>0.05)。3.研究RYBP及BMI1在AL中的相关性发现:在AML中RYBP与BMI1蛋白均高表达,表达阳性率及表达量无显着差异(P>0.05);RYBP与BMI1两者表达水平有显着相关性(r=0.640, P<0.01)。4. LSD1表达情况:SHI-1、HL-60及K562细胞株LSD1蛋白表达均为强阳性;17例非恶性血液病对照中LSD1蛋白表达阴性。AL组的LSD1蛋白表达阳性率为78.6%,ALCR组阳性率为4.2%,AL组的LSD1蛋白表达阳性率及表达量比ALCR组及对照组明显增高(P<0.05);其中初治的急性髓系白血病(AML)组和急性淋巴细胞白血病(ALL)组LSD1蛋白表达阳性率及表达量均明显高于对照组(P<0.05),而AML和ALL两组间的LSD1蛋白表达阳性率及表达量无显着差异(P>0.05)。结论:1.血液系统非恶性疾病患者骨髓MNCs低表达RYBP、BMI1及LSD1蛋白,而白血病细胞株细胞明显地高表达;在急性白血病患者,初诊时骨髓MNCs中RYBP、BMI1及LSD1蛋白表达量大多明显升高,治疗后达到完全缓解时表达量明显下降。这些初步结果说明白血病细胞高表达RYBP、BMI1及LSD1蛋白。提示RYBP、BMI1及LSD1蛋白与急性白血病密切相关,可能在急性白血病的发病中起作用并有可能开发成为急性白血病新的生物标志物。2. RYBP与BMI1的表达水平在AML中显着相关,提示在急性髓细胞白血病发病中可能存在RYBP与BMI1相互作用。提示在白血病发病过程中PcG蛋白可能形成相互作用异常多蛋白复合体。
乔淑凯, 徐世荣, 郭晓楠, 王颖[6]2004年在《急性白血病患者DNA甲基转移酶基因的表达及临床意义》文中提出目的:为了探讨DNA甲基转移酶(DNMTs)基因在成人急性白血病(AL)患者中的表达及其与临床预后之间的关系。方法:采用逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)方法对72例AL患者和20例正常人的骨髓进行DNMTs、p15~(INK4B)、mdr1 mRNA水平的检测。采用甲基化特异性PCR(MSP-PCR)方法,检测56例AL患者和14例正常人p15~(INK4B)基因启动子区域CpG岛甲基化率。结果:(1)AL患者组所有叁种
田劭丹[7]2006年在《复方浙贝母颗粒辅助化疗治疗难治性急性白血病临床研究》文中认为白血病是血液系统的恶性肿瘤,其死亡率较高,危害较大,且近50年来发病率有所增加。根据目前国情,联合化疗仍是治疗白血病最主要的方法。尽管不断有新的化疗药物和改进的化疗方案推出,白血病细胞对化疗药物产生多药耐药(MDR)一直是导致白血病难治和化疗失败的主要原因,也是白血病患者治疗费用上扬的主要原因。然而,目前尚无理想的多药耐药逆转剂进入临床。因此,寻找低毒、高效、功能专一性强且作用靶点广泛的耐药逆转剂已成为难治性急性白血病临床治疗急需解决的关键性问题。长期临床实践证明,中药配合化疗治疗白血病,能够明显改善患者临床症状,提高缓解率与生存质量,延长生存期。其治疗机理与中药对白血病患者机体综合调理、提高免疫功能、有效杀伤白血病细胞、诱导白血病细胞凋亡有密切关系,除此之外,中药在逆转白血病MDR中的作用和地位也不容质疑。近些年来研究证实,多种中药具有逆转MDR生物活性成分,这进一步说明中药在提高难治性白血病临床疗效方面具有潜在临床应用前景和开发的商业价值,值得进行深入研究。本课题正是基于这一目的与以往的基础研究及临床预试验研究,采用随机双盲、多中心的病例对照研究方法,以“复方浙贝母颗粒”为治疗药物,以“麦芽颗粒”为对照药物,以难治性急性白血病患者为研究对象,以临床缓解率为主要评价指标,并拟定统一疗效评估标准,进行复方浙贝母颗粒干预围化疗期难治性急性白血病临床疗效及逆转白血病多药耐药的规范化临床研究。全部病例资料来自12家叁级甲等医院于2004年1月至2006年4月间所观察的135例难治性急性白血病患者。进入统计的病例共126例,治疗组65例,对照组61例。研究结果表明:①按急性白血病临床疗效评定标准,治疗组完全缓解29例,占44.6%;部分缓解23例,占35.4%;未缓解13例,占20.0%;总有效率为80%。对照组完全缓解15例,占24.6%;部分缓解17例,占27.9%;未缓解29例,占47.5%;总有效率为52.5%。两组总有效率比较,具有统计学意义,P<0.01,治疗组明显优于对照组。②骨髓白血病细胞百分比治疗前后相比,治疗组和对照组均具有统计学意义,P<0.01。治疗后骨髓白血病细胞百分比两组间比较具有统计学意义,P<0.01,治疗组明显低于对照组,即治疗组骨髓白血病细胞百分比下降幅度大。③入组时,治疗组和对照组病例白细胞计数比较,具有统计学意义,P<0.05,治疗组白细胞计数明显高于对照组,治疗组中高白细胞性白血病(WBC>100×109/L)病例比例较高,占21.5%,对照组中高白细胞性白血病病例比例仅占6.6%。治疗第2周及1疗程时,白细胞计数与治疗前比较,治疗组和对照组均明显下降,具有统计学意义,P<0.01。治疗后白细胞计数两组间比较,无统计学意义,P>0.05。④治疗后血红蛋白值、红细胞计数、血小板计数两组间比较,均无统计学意义,P>0.05。⑤对于难治性AML患者,治疗组的疗效优于对照组;病程<6个月的难治性急性白血病患者疗效最好;对于男性AL患者,治疗组的疗效优于对照组。⑥治疗组仅1例(1.52%)判断为可能与受试药物有关的不良反应,表现为恶心呕吐,但并不影响治疗。
胡婉丽[8]2014年在《HL-60细胞ID4基因甲基化检测及阿扎胞苷抑制效应研究》文中认为目的：复发一直是困扰白血病治疗的重大难题,目前发现基因突变的检测能指导治疗。表观遗传修饰(epigenetics modification)对肿瘤相关基因的表达起了关键的调控作用,DNA甲基化作为表观遗传修饰的改变之一,在白血病的发生、发展过程中起重要作用。阿扎胞苷作为去甲基化药物的代表,已经于2004年被美国FDA批准用于骨髓增生异常综合征的治疗。但阿扎胞苷治疗急性白血病的分子机制,以及其对ID4基因甲基化的影响仍需要进一步的阐释。为此,本研究检测了人急性髓系白血病细胞株HL-60细胞DNA结合抑制因子4(inhibitor of DNA binding,ID4)基因的甲基化状态,研究阿扎胞苷对HL-60细胞的抑制效应及对ID4基因的去甲基化作用,从而探寻白血病治疗的新靶点,为去甲基化药物治疗白血病提供实验资料。方法：体外培养人急性髓系白血病细胞株HL-60细胞,应用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation Specificity Polymerase Chain Reaction, MS-PCR)方法检测HL-60细胞中ID4基因的甲基化状态。利用CCK8方法分别测定HL-60细胞用不同浓度组阿扎胞苷作用48h后的增殖变化。MS-PCR方法检测HL-60细胞用不同浓度组阿扎胞苷处理后ID4基因的甲基化变化情况。逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)法检测不同浓度组阿扎胞苷处理HL-60细胞48h后ID4基因的表达变化。结果：MS-PCR法检测结果显示：HL-60细胞的ID4基因呈完全甲基化状态。CCK8法检测结果显示：各浓度组阿扎胞苷作用HL-60细胞48h后抑制率分别为11.11%,36.67%,58.89%,78.89%。各组之间比较均有显着性差异(P<0.05)。MS-PCR检测结果显示：对照组呈完全甲基化状态,0.5μM、1μM和2μM浓度组呈部分甲基化状态,5μM浓度组呈完全非甲基化状态。RT-PCR检测结果显示：除0μ M和0.5μM浓度组外,HL-60细胞经1μM,2μM,5μ M各浓度组阿扎胞苷作用48h后,ID4基因的表达量随着药物浓度的增加而增加。结论：1.HL-60细胞ID4基因的甲基化状态是其恶性增殖的机制之一。2.甲基化转移酶抑制剂阿扎胞苷在体外对HL-60细胞增殖的抑制作用在一定范围内呈现剂量依赖性。3.阿扎胞苷可以逆转HL-60细胞中ID4基因的甲基化状态,从而解除对ID4基因表达的抑制作用,并且在一定范围内呈现一定的剂量依赖性。
徐燕霞[9]2017年在《去甲基化治疗前后全基因组甲基化水平变化在急性髓系白血病预后判断中的作用》文中认为第一部分急性髓系白血病患者外周血m6A RNA水平检测【目的】分析急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者外周血总RNA中6-甲基腺嘌呤(m6A)水平在去甲基化治疗前后变化,并探讨其水平改变与AML临床特点的相关性及对预后的影响。【方法】以2015年1月至2017年3月于苏州大学附属第二医院血液科就诊的经地西他滨15-20mg/(m2·d)×3~5d方案联合化疗治疗的40例AML患者(男性22例,女性18例,中位年龄60岁)为研究对象,分别在地西他滨去甲基化治疗前1天(-1d)、治疗后7天(7d)及治疗后14天(14d)采集外周血,采用比色法定量检测外周血总RNA中6-甲基腺嘌呤含量。按病期将AML患者分为初治组(15例)、复发难治组(8例)、缓解组(17例),其中以缓解组作为阳性对照组,以18例健康体检者作为正常对照组。【结果】(1)AML患者各诊断亚型的m6A含量初治组m6A含量为0.547±0.115ng(0.176~1.955ng),复发难治组m6A含量为0.321±0.046ng(0.108~0.461ng),均高于两对照组,差异有统计学意义(p<0.01);初治组高于难治复发组,差异无统计学意义(p>0.05);正常对照组m6A含量为0.200±0.032ng(0.0617~0.5773ng),缓解组(阳性对照组)m6A含量为0.286±0.039ng(0.079~0.643ng),两组接近,差异无统计学意义(p>0.05)。(2)初治组经地西他滨去甲基化治疗后7天及14天,m6A含量分别为0.252±0.030ng(0.095~0.397 ng),0.241±0.057ng(0.100~0.755 ng),与治疗前比较,叁个时间点差异具有统计学意义(p<0.05);复发难治组患者去甲基化治疗后7天和14天m6A含量分别为0.251±0.033ng(0.124~0.374 ng)和0.227±0.030ng(0.134~0.300ng),均较治疗前下降,差异无统计学意义(p>0.05);阳性对照组去甲基化治疗前后m6A改变差异有统计学意义(p<0.05)。(3)经地西他滨治疗1疗程,初治及复发难治23例患者中9例获CR,5例获PR,9例NR。治疗前获CR的患者m6A含量为0.545±0.168(0.159~1.955),NR患者m6A含量为0.386±0.090(0.102~1.010),与正常组相比,叁组有统计学差异(p<0.05);CR组明显高于正常组,差异有统计学意义(p<0.05),CR组与NR组差异无统计学意义(p>0.05)。CR组和NR组在治疗后7天、14天的m6A含量较治疗前下降量分为0.405±0.155(0.160~1.615)和0.117±0.075(-0.114~0.654),获CR患者较未获CR患者m6A下降幅度大(p<0.05)。(4)治疗前m6A含量与患者的性别、年龄、FAB分型、染色体异常、基因突变、原始细胞计数、白细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数等各临床特征无明显相关性(p>0.05)。(5)生存分析示:以23例(初治和复发难治)患者治疗前m6A水平中位数0.359(0.018~0.501)为界点分为两组,m6A<0.359组患者OS及DFS均较m6A≥0.359组患者较长。【结论】1.初治及复发难治的AML患者m6A RNA水平均较正常人及缓解患者高。2.地西他滨去甲基化治疗后m6A RNA水平均下降,以初治组下降更明显。3.m6A RNA甲基化水平对AML患者的OS及DFS有影响,对患者治疗疗效及短期预后判断有指示意义。第二部分UCK1、UCK2、DCK基因在急性髓系白血病患者去甲基化治疗前后的表达变化及其在预后判断中的作用【目的】探讨髓系恶性肿瘤急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者去甲基化治疗前后UCK1、UCK2、DCK基因表达的改变情况,并分析对预后的影响。【方法】以2015年1月至2017年3月于苏州大学附属第二医院血液科就诊的经地西他滨15-20mg/(m2·d)×3~5d方案联合化疗治疗的40例AML患者(男性22例,女性18例,中位年龄60岁)为研究对象,分别在地西他滨去甲基化治疗前1天(-1d)、治疗后7天(7d)及治疗后14天(14d)采集外周血,采用荧光定量PCR的方法检测外周血中UCK1、UCK2、DCK基因的表达情况。按病期将AML患者分为初治组(15例)、复发难治组(8例)、缓解组(17例),其中以缓解组作为阳性对照组,以18例健康体检者作为正常对照组。【结果】1.治疗前AML患者UCK1、UCK2、DCK基因m RNA表达40例患者中,治疗前各组AML患者DCK基因ΔCt值示:缓解组>正常对照组>初治组>复发难治组,复发难治组DCK的表达最高,差异具有统计学意义(p<0.05),初治组DCK表达高于缓解组和正常对照组,差异有统计学意义(p<0.05),缓解组与正常对照组差异无统计学意义(p>0.05);UCK2基因ΔCt值示:复发难治组>初治组>缓解组>正常对照组,复发难治组UCK2的表达最低,差异具有统计学意义(p<0.05),初治组UCK2表达低于缓解组和正常对照组,差异有统计学意义(p<0.05),缓解组与正常对照组差异无统计学意义(p>0.05);四组UCK1基因的ΔCt值接近,表明四组患者的UCK1基因表达差异无统计学意义(P>0.05)。2.地西他滨去甲基化治疗后UCK1、UCK2、DCK基因m RNA表达变化初治组:DCKΔCt:14d(12.842±1.58)>7d(7.984±0.836)>-1d(5.023±0.261),表明患者DCK的表达在治疗后14天最低,与治疗前1天和治疗后7天比较,差异有统计学意义(p<0.01);治疗后7天DCK表达量低于治疗前,差异无统计学意义(p=0.051)。UCK1、UCK2基因的表达在治疗前后接近,差异无统计学意义(p>0.05)。复发难治组:DCKΔCt:14d(6.097±0.513)>7d(5.370±0.707)>-1d(4.936±0.715);表明患者DCK表达在治疗后14天最低,与治疗前和治疗后7天比较,差异无统计学意义(p>0.05);UCK2ΔCt:14d(10.205±1.198)>7d(9.840±1.048)>-1d(9.071±0.859),患者治疗前与治疗后7天、14天UCK2基因表达差异无统计学意义(p>0.05);UCK1ΔCt:7d(6.759±0.902)>14d(6.641±1.220)>-1d(5.840±0.740),治疗前后UCK1基因表达差异无统计学意义(p>0.05)。缓解组:DCKΔCt:14d(10.284±1.082)>7d(9.563±0.848)>-1d(8.084±0.673);患者DCK表达在治疗后14天最低,与治疗前、治疗后7天比较差异有统计学意义(p<0.05);UCK2ΔCt:7d(6.982±1.364)>14d(6.380±1.164)>-1d(5.805±1.025),治疗前后UCK2基因表达差异无统计学意义(p>0.05);UCK1ΔCt:7d(5.385±0.595)>14d(5.064±0.652)>-1d(3.752±0.642),患者治疗前后UCK1基因表达变化不大,差异无统计学意义(p>0.05)。3.UCK1、UCK2、DCK叁个基因的表达均与各临床特征间无显着相关性。(p>0.05)4.生存分析:分别以23例(初治和复发难治)患者治疗前UCK1、UCK2、DCK表达水平中位数5.35(0.23~9.06)、8.17(1.97~15.09)、4.76(2.76~9.26)为界点各分为两组,ΔCt(UCK1)≥5.35组患者OS较ΔCt(UCK1)<5.35患者较长,UCK1的表达对DFS无影响;UCK2对患者的OS及DFS均无明显影响;ΔCt(DCK)≥4.71组患者DFS较ΔCt(DCK)<4.71组患者较长,对OS的影响较小。【结论】1.初治组和复发难治组患者DCK基因的表达均高于正常人和缓解的患者;相反,初治组和复发难治组患者UCK2基因的表达均低于正常人和缓解组患者。2.AML随着地西他滨用药时间的拉长,初治组患者DCK基因的表达逐渐下降。而与UCK1、UCK2基因表达关系不强。3.DCK基因的表达对患者OS及DFS均有影响,对治疗疗效及预后判断具有指示意义。
姚婕[10]2009年在《白血病中雌激素受体启动子CpG岛甲基化的实验研究》文中提出目的:目前启动子甲基化的研究主要集中在单启动子基因调节,多启动子基因调节比单启动子更复杂。雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)有四个启动子,其甲基化研究以往多集中在性激素依赖性肿瘤。本实验利用MSP检测白血病细胞株中ER多个启动子甲基化情况,分析去甲基化剂处理白血病细胞株前后雌激素受体甲基化状态及表达的变化,阐明雌激素受体表观遗传学变化对该受体在白血病中表达的影响;分析白血病患者雌激素受体各启动子甲基化状态及表达,探讨筛选某启动子甲基化成为白血病早期诊断、治疗监测与预后判断分子标志物的可能性。揭示ER启动子甲基化与ER mRNA表达及蛋白表达的关系,为肿瘤的形成与DNA甲基化的关系提供理论依据,从而为肿瘤的治疗提供新的方向。方法:1.白血病细胞株HL-60、K562、Jurkat、Molt-4、U937和THP-1的培养以及5-Aza CdR对细胞株的处理。2.利用MSP和甲基化产物测序检测白血病细胞株在5-Aza CdR处理前后ERa-A, -B,–C和ERβ、启动子CpG岛甲基化状态。3.运用RT-PCR检测5-Aza CdR处理前后ERa-A, -B,–C和ERβmRNA的表达。4.运用Western-blot检测5-Aza CdR处理前后ERa和ERβ蛋白表达的差异。5.以台盼蓝染色计数实验,3H-TDR插入实验和PI单染色法检测6种白血病细胞株以5′-Aza-Dc去甲基化前后细胞的活力,周期和增殖。6.以PI单染色法检测6种白血病细胞株以5′-Aza-Dc去甲基化前后细胞凋忘。7.运用MSP和PT-PCR检测40例白血病患者(未治疗)和10例正常人外周血ERa-A, -B and–C和ERβ启动子CpG岛甲基化和其表达情况。8.对40例白血病人的预后情况进行一年的追踪。结果:1.MSP检测白血病细胞株HL-60、K562、Jurkat、Molt-4、U937和THP-1ER启动子甲基化显示:在六株白血病细胞株中,ERa-A, -B,–C和ERβ启动子CpG岛处于甲基化状态,但只有ERa-A mRNA表达失活。2.5-Aza CdR处理HL-60、K562、Jurkat、Molt-4、U937和THP-1后,ERa-A, -B,–C和ERβ启动子CpG岛发生去甲基化,ERa-A mRNA恢复表达。3.5-Aza CdR处理白血病细胞株后ERa蛋白表达较处理前ERa蛋白表达显着增强(p<0.01),而5-Aza CdR处理白血病细胞株后ERβ蛋白表达较处理前ERβ蛋白表达无明显差异。4.5-Aza CdR处理白血病细胞株后细胞的活力,周期和增殖较处理前明显下降(p<0.01)。5.5-Aza CdR处理白血病细胞株后细胞的凋亡较处理前明显增加(p<0.01)。6.利用MSP和RT-PCR检测40例白血病患者白细胞ERa-A, -B,–C和ERβ启动子CpG岛甲基化情况和mRNA表达情况,结果ERa-A甲基化阳性率为95%,而正常人白细胞ERa-A却没有发生甲基化。ERa-B,–C和ERβ在白血病患者白细胞和正常人白细胞中均发生甲基化。40例白血病患者白血病细胞ERa-A, -B,–C和ERβmRNA表达情况,结果只有ERa-A表达缺失(95%),而ERa-B,–C和ERβ表达正常。7.对40例白血病人的预后情况进行一年的追踪后,发现两例ERa-A未甲基化的女性病人对化疗药物敏感,预后良好。结论:1.白血病细胞株雌激素受体两个亚型的ERa-A, -B, -C和ERβ启动子CpG岛是处于高甲基化状态,而只有ERa-A mRNA不表达。2.用5-Aza CdR处理白血病细胞株后,ERa-A, -B,–C和ERβ启动子CpG岛发生去甲基化,ERa-A mRNA出现表达,说明ERa-A启动子甲基化导致ERa-A mRNA表达失活。3.通过对5-Aza CdR处理白血病细胞株前后ERa和ERβ的蛋白表达分析,结果发现去甲基化后6株白血病细胞ERa蛋白表达均明显增强(p<0.01),而ERβ蛋白表达无明显改变。4.运用台盼蓝染色计数实验,3H-TDR插入实验和PI单染色法分析5-Aza CdR处理血病细胞株前后细胞活力,周期和增殖的改变,发现甲基化后6株白血病细胞细胞活力,周期和增殖明显降低(p<0.01)。以PI单染色法分析5-Aza CdR处理血病细胞株前后细胞凋亡的改变,发现甲基化后6株白血病细胞细胞凋亡明显增多(p<0.01)。5.白血病患者(未治疗)外周血标本ERa-A启动子CpG岛发生甲基化为95%,表达缺失95%,而正常人没有发生甲基化且表达正常。ERa-A启动子甲基化有可能成为白血病诊断的潜在的标志物。6.ERa-A启动子CpG岛发生甲基化还能为白血病人的内分泌治疗方案的选择及其预后判断提供理论依据。
参考文献：
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