肠炎沙门氏菌应对乙醇胁迫的抗性形成机制

论文摘要

沙门氏菌（Salmonella）是一种非常重要的食源性致病菌,它可以分为2610多种血清型,其中肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis）是引起食物中毒的最主要血清型。消毒处理是食品工业中常用的杀菌手段,但消毒剂因自身不稳定、使用不合理等原因,常以亚致死浓度存在于食品加工环境中,进而诱导沙门氏菌产生抗性,包括对同一消毒剂由低浓度到高浓度的直接抗性以及对其他压力因子的交叉抗性,从而导致消毒剂不能将沙门氏菌等食源性致病菌完全杀灭,给食品带来了极大的安全隐患。因此,阐明沙门氏菌应对消毒剂胁迫的抗性形成机制,进而指导人们有效使用食品工业现有消毒剂,或者开发沙门氏菌新型控制技术,在实际生产中具有重要意义。乙醇是食品工业中最常用的醇类消毒剂,它也是一种食品保鲜剂和食品加工助剂。同时,它普遍存在于水果、果汁、酒精饮料和发酵食品中。虽然已经证实亚致死浓度的乙醇胁迫可以诱导一些食源性致病菌（如副溶血弧菌和阪崎克罗诺杆菌）形成直接抗性和交叉抗性,但目前尚不清楚沙门氏菌能否有效应答乙醇胁迫进而产生抗性。因此,本研究拟阐明乙醇胁迫诱导肠炎沙门氏菌直接抗性和交叉抗性的形成规律,从转录水平分析抗性表型与压力基因表达变化之间的相关性,并以乙醇胁迫诱导出的乙醇直接抗性和冷冻交叉抗性为代表,进一步通过蛋白质组学分析技术和基因敲除技术解析肠炎沙门氏菌应对乙醇胁迫的抗性形成机制。主要研究内容和结果如下:1、乙醇胁迫诱导肠炎沙门氏菌形成直接抗性和交叉抗性的表型分析。通过平板计数法、最低抑/杀菌浓度法或者纸片扩散法,分析乙醇胁迫后肠炎沙门氏菌的抗性特征变化规律。结果表明:a)2.5-10%的乙醇胁迫均能够诱导肠炎沙门氏菌形成直接抗性,当乙醇浓度为5%时,诱导抗性已达到最大值;b)乙醇胁迫在LB培养基中的稳定性受温度的影响,在4℃、25℃和37℃三个温度条件下,暴露温度越低,诱导抗性持留时间越长;此外,鸡肉汁可以维持乙醇胁迫的稳定性,猪肉汁能够提高乙醇胁迫的稳定性;c)乙醇胁迫诱导肠炎沙门氏菌对-20℃、过氧化氢和苹果酸形成交叉抗性,但不能对4℃、50℃、氯化钠、氯化钾、氢氧化钠、氢氧化钾、乙酸、盐酸、乳酸、抗坏血酸、柠檬酸、四环素、强力霉素、头孢曲松、氨苄西林、氨曲南、氯霉素、诺氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、阿米卡星、庆大霉素、头孢他啶和头孢噻吩等压力因子产生交叉抗性;d)肠炎沙门氏菌在4℃橙汁、25℃橙汁和4℃苹果汁中的存活率并未受乙醇胁迫的影响,但其在25℃苹果汁中的存活率经乙醇胁迫后显著提高,即对25℃苹果汁产生了交叉抗性。为了揭示乙醇胁迫对肠炎沙门氏菌细胞壁膜特征的影响规律,开展了细胞膜通透性和流动性以及细胞自凝集能力、表面形态和表面疏水性的测定。结果表明:乙醇胁迫能够降低肠炎沙门氏菌的细胞表面疏水性,提高菌体的自凝集能力,但并没有改变菌体的细胞膜完整性和流动性。2、肠炎沙门氏菌响应乙醇胁迫的基因表达分析。借助荧光定量PCR测定81个抗性相关基因在乙醇胁迫后相对表达量的变化,从而在转录水平上解析肠炎沙门氏菌对乙醇胁迫的抗性应答策略。结果表明:a)与对照组菌体相比,乙醇胁迫组菌体的酸抗性相关基因rpoS（编码RNA聚合酶的σ因子）和SEN1564A（编码酸休克蛋白质）的表达显著上调;b)热抗性相关基因（rpoH、dnaK和dnaJ）的表达在乙醇胁迫后并没有发生显著变化;c)主要冷休克基因cspA的表达在乙醇胁迫后显著下调,但其他冷休克基因（cspB、cspC、cspD和cspE）的表达无显著变化;d)在检测的8个氧化抗性相关基因（katG、sodA、katE、tpx、hslO、bcp、SEN0385和oxyR）中,只有过氧化氢酶基因katG在乙醇胁迫后表达显著下调,其他7个基因的表达无显著变化;e)乙醇胁迫对细胞壁膜完整性相关基因（tolA、mreB、mreC、mreD、mrdB和yjeE）的表达没有显著影响。3、乙醇直接抗性和冷冻交叉抗性形成的蛋白质组学分析。聚焦乙醇胁迫诱导效果最为显著的乙醇直接抗性和冷冻交叉抗性两种表型,通过iTRAQ技术全面挖掘抗性形成相关的蛋白质,借助荧光定量PCR技术对蛋白质组学结果进行验证,并探索乙醇胁迫诱导肠炎沙门氏菌抗性形成相关的调控网络。结果表明:a)乙醇胁迫后,肠炎沙门氏菌有138个蛋白质的表达发生显著变化（56个蛋白质表达上调、82个蛋白质表达下调）;b)对乙醇胁迫的菌体进行冷冻处理过程中,肠炎沙门氏菌有185个蛋白质的表达发生显著变化（88个蛋白质表达上调、97个蛋白质表达下调）;c)测试的10个差异蛋白质在mRNA和蛋白质水平上的表达变化规律基本相符,在一定程度上证实了iTRAQ结果的可靠性;d)对所有差异蛋白质所涉及的功能类群进行分析,发现肠炎沙门氏菌主要通过基础代谢（如嘌呤代谢和氨基酸代谢）、ABC转运子、铁载体合成与吸收、调控子、蛋白质合成和毒力岛等多种途径调控乙醇直接抗性和冷冻交叉抗性的形成。4、hiuH和proX负调控乙醇直接抗性和冷冻交叉抗性的形成。根据蛋白质表达规律、差异蛋白质功能信息、抗性应答调控网络和荧光定量PCR结果,选择了嘌呤代谢相关蛋白质HiuH（5-羟基异尿酸水解酶）和ABC转运子相关蛋白质ProX（甜菜碱结合蛋白质）进行功能鉴定。结果表明:a)依据同源重组原理,借助克隆载体pMD19-T和高效蔗糖自杀质粒pRE112,成功构建了hiuH和proX基因的缺失突变株（⊿hiuH和⊿proX）和回复互补株（⊿hiuH-C和⊿proX-C）;b)hiuH和proX的缺失均没有显著改变肠炎沙门氏菌在LB培养基中的生长速率,也未明显影响该菌在乙醇胁迫和冷冻处理后的细胞表面形态;c)乙醇胁迫的野生型菌株与突变株在冷冻处理后均出现了丝状化的细胞形态,暗示细胞丝状化可能是肠炎沙门氏菌形成冷冻交叉抗性的一种策略;d)乙醇胁迫后,⊿hiuH和⊿proX突变株的乙醇抗性和冷冻抗性均显著高于野生型菌株,并且回复株和野生型菌株的抗性特征无显著差异,说明hiuH和proX能够负调控肠炎沙门氏菌乙醇直接抗性和冷冻交叉抗性的形成。综上可知,乙醇胁迫对肠炎沙门氏菌抗性的影响取决于所研究的压力因子的种类,并且一些抗性表型的变化可归因于相关基因表达的改变。其中,乙醇胁迫能够诱导肠炎沙门氏菌对乙醇形成直接抗性以及对冷冻、苹果酸和过氧化氢形成交叉抗性。肠炎沙门氏菌乙醇直接抗性和冷冻交叉抗性的形成是基础代谢（如嘌呤代谢和氨基酸代谢）、ABC转运子、铁载体吸收、调控子、蛋白质合成和毒力岛等多个网络调控的作用结果,并且嘌呤代谢通路的hiuH和ABC转运子途径的proX能够负调控这两种抗性的形成。上述研究较全面地揭示了肠炎沙门氏菌应对乙醇胁迫的抗性形成机制,为控制受乙醇胁迫而形成抗性的沙门氏菌奠定理论基础。

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摘要

ABSTRACT

符号说明

第一章绪论

1.1 沙门氏菌

1.1.1 沙门氏菌的基本特性

1.1.2 沙门氏菌的命名和分类

1.1.3 沙门氏菌与食物中毒

1.1.4 沙门氏菌的抗性

1.2 乙醇在食品工业中的应用

1.2.1 乙醇在食品工厂消毒中的应用

1.2.2 乙醇在食品贮藏和保鲜中的应用

1.2.3 乙醇在食品工业中的广泛应用引发的问题

1.3 食源性致病菌对乙醇胁迫的抗性应答研究进展

1.3.1 食源性致病菌的乙醇胁迫抗性应答反应特征

1.3.2 食源性致病菌的乙醇胁迫抗性应答反应机制

1.3.3 食源性致病菌乙醇胁迫抗性应答研究的局限性

1.4 iTRAQ技术在食源性致病菌抗性形成机制研究中的应用

1.4.1 蛋白质组学研究技术

1.4.2 iTRAQ技术的原理和优势

1.4.3 iTRAQ技术用于食源性致病菌抗性形成机制研究

1.5 研究的目的、意义及思路

第二章乙醇胁迫诱导肠炎沙门氏菌形成直接抗性和交叉抗性的表型分析

2.1 材料与设备

2.1.1 菌株

2.1.2 主要培养基及试剂

2.1.3 主要仪器与设备

2.2 实验方法

2.2.1 肠炎沙门氏菌的活化

2.2.2 乙醇抑菌作用的测定

2.2.3 乙醇胁迫处理

2.2.4 直接抗性形成能力的评估

2.2.5 交叉抗性形成能力的评估

2.2.6 细胞壁膜特性的测定

2.2.7 数据分析

2.3 结果与分析

2.3.1 乙醇胁迫浓度的确定

2.3.2 乙醇胁迫对肠炎沙门氏菌直接抗性的诱导效果

2.3.3 乙醇胁迫对肠炎沙门氏菌交叉抗性的诱导效果

2.3.4 乙醇胁迫对肠炎沙门氏菌细胞壁膜特征的影响

2.4 小结与讨论

第三章肠炎沙门氏菌响应乙醇胁迫的基因表达分析

3.1 材料与设备

3.1.1 菌株

3.1.2 主要培养基及试剂（盒）

3.1.3 主要仪器与设备

3.2 实验方法

3.2.1 乙醇胁迫处理

3.2.2 总RNA的提取

3.2.3 基因组DNA的去除

3.2.4 cDNA的合成

3.2.5 RT-qPCR引物的设计与合成

3.2.6 抗性相关基因的表达分析

3.2.7 数据分析

3.3 结果与分析

3.3.1 肠炎沙门氏菌的总RNA

3.3.2 基因组DNA的去除效果

3.3.3 抗性相关基因的整体表达情况

3.3.4 酸抗性相关基因的表达

3.3.5 低温抗性相关基因的表达

3.3.6 高温抗性相关基因的表达

3.3.7 氧化抗性相关基因的表达

3.3.8 盐抗性相关基因的表达

3.3.9 细胞壁膜相关基因的表达

3.4 小结与讨论

第四章乙醇直接抗性和冷冻交叉抗性形成的蛋白质组学分析

4.1 材料与设备

4.1.1 菌株

4.1.2 主要培养基及试剂（盒）

4.1.3 主要仪器与设备

4.2 实验方法

4.2.1 乙醇胁迫和冷冻处理流程

4.2.2 乙醇直接抗性和冷冻交叉抗性测定

4.2.3 总蛋白质提取

4.2.4 SDS-PAGE电泳

4.2.5 酶解和肽段定量

4.2.6 iTRAQ标记

4.2.7 强阳离子色谱分级

4.2.8 毛细管高效液相色谱分离

4.2.9 质谱鉴定

4.2.10 数据分析

4.2.11 蛋白质组学结果的RT-q PCR验证

4.2.12 差异蛋白质的GO注释、KEGG通路和互作关系分析

4.2.13 乙醇直接抗性和冷冻交叉抗性应答网络分析

4.3 结果与分析

4.3.1 乙醇直接抗性和冷冻交叉抗性形成能力

4.3.2 蛋白质样品的电泳分析

4.3.3 蛋白质鉴定的基本信息

4.3.4 蛋白质的相对定量分析

4.3.5 蛋白质组学结果的RT-q PCR验证

4.3.6 差异蛋白质的GO注释、KEGG通路和互作关系分析

4.3.7 乙醇直接抗性应答网络分析

4.3.8 冷冻交叉抗性应答模式分析

4.4 小结与讨论

第五章 hiu H和 pro X负调控乙醇直接抗性和冷冻交叉抗性的形成

5.1 材料与设备

5.1.1 菌株和质粒

5.1.2 主要培养基、试剂（盒）及工具酶

5.1.3 主要仪器与设备

5.2 实验方法

5.2.1 hiu H和 pro X基因缺失突变株和回复株的构建

5.2.2 肠炎沙门氏菌生长曲线的测定

5.2.3 肠炎沙门氏菌的细胞表面形态观察

5.2.4 肠炎沙门氏菌的乙醇直接抗性形成能力评估

5.2.5 肠炎沙门氏菌的冷冻交叉抗性形成能力评估

5.2.6 数据分析

5.3 结果与分析

5.3.1 hiu H和 pro X基因缺失突变株和回复株的构建

5.3.2 野生型菌株、突变株和回复株的生长速率

5.3.3 乙醇胁迫对野生型菌株和突变株细胞表面形态的影响

5.3.4 冷冻处理对野生型菌株和突变株细胞表面形态的影响

5.3.5 野生型菌株、突变株和回复株的乙醇直接抗性形成能力

5.3.6 野生型菌株、突变株和回复株的冷冻交叉抗性形成能力

5.4 小结与讨论

第六章结论与展望

6.1 主要结论

6.2 特色与创新

6.3 展望

参考文献

附录1

附录2

附录3

附录4

附录5

致谢

攻读学位期间已发表和投稿中的学术论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 何守魁

导师: 唐鸿志,史贤明

关键词: 肠炎沙门氏菌,乙醇胁迫,抗性基因,蛋白质组学,羟基异尿酸水解酶,甜菜碱结合蛋白质

来源: 上海交通大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 上海交通大学

基金: 国家重点研发计划(No.2016YFE0106100&2016YFD0401102),国家自然科学基金重点项目(No.31230058)

分类号: TS201.3

DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.000268

总页数: 172

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