新型上转换荧光纳米探针的构建及细胞成像分析研究

论文摘要

生物化学分子的超灵敏检测在食品安全、临床诊断、环境监测、反生物恐怖主义和生物医学研究等领域,显得尤为重要。荧光探针由于其制备简易、响应灵敏度高、选择性好及成像时空分辨率高等优点,逐渐成为分子传感和成像的有力工具之一。上转换材料如上转换纳米颗粒（UCNPs）和双光子荧光分子与传统荧光材料相比,拥有光损伤小,背景自体荧光少、组织深度穿透等优点,这些优势的存在,让它们在生物医学和诊断等领域得到广泛的关注和应用。然而,在实际应用中,上转换材料也面临着一些亟待解决的问题,如UCNPs水分散性差、生物相容性低、设计识别位点难,而双光子有机小分子探针细胞膜穿透能力差、抗光漂白能力弱。为了解决现在面临的问题,本论文将UCNPs与介孔二氧化硅（mSiO2）、β-环糊精（βCD）或双光子荧光分子与球形核酸（SNA）等分别结合在一起构建新型上转换荧光纳米探针用于生物体内生物化学分子的成像及检测,具体开展的研究内容如下:1.鉴于UCNPs独特的光学特性,本章设计了一种用于测定活细胞和组织内一氧化氮（NO）含量的比率型上转换荧光纳米探针。mSiO2包覆UCNPs大大提高了探针的水溶性和生物相容性;采用βCD堵孔不仅提高探针生物相容性还基于尺寸效应明显提高探针的选择性。最后,该探针成功用于缓冲溶液、细胞、大鼠血清及组织中NO的检测。2.基于上一章的工作,本章设计了一种比率型上转换荧光纳米探针用于细胞及组织中一氧化碳（CO）的检测及成像研究。该探针的mSiO2壳层内包覆CO识别分子（Pd-RdMs）,并采用βCD堵孔提高探针的选择性和生物相容性。该探针除了能用于缓冲液中CO的分析检测,还可用于活细胞和组织中CO的测定及成像,并成功用于研究小鼠肝缺血再灌注（HIR）过程中奥曲肽（OCT）的保护作用。3.本章通过结合pH敏感的双光子荧光染料反式-4-[p-（N,N-二乙氨基）苯乙烯基]-N-甲基吡啶碘（DMI）与pH不敏感的UCNPs构建了一种新型双光子激发的荧光纳米pH探针（UCNP@DMI-mSiO2@βCD）。该探针稳定性好、灵敏度高,可实现溶酶体中pH值的上转换比率成像,以及氧化还原性物质刺激后细胞内pH在活细胞和组织中的变化研究。4.鉴于双光子荧光染料独特的光谱性质,本章构建了一种双光子纳米探针,通过将双光子荧光染料乙基-4-[3,6-双（1-甲基-4-乙烯基异丁碘）-9H-氨基甲酸酯-9-基)]（EBMVC）与表面自组装有DNA/RNA双链的SNA结合在一起来检测核糖核酸酶H（RNase H）活性。基于RNase H对DNA/RNA双链的水解特异性,该探针结合EBMVC独特的光谱优势和SNA独特的抗酶降解、核酸结合力增强和优异的细胞摄取能力被用于缓冲溶液、活细胞和组织中RNase H的检测。5.基于上一章的工作,本章设计了一种新型双光子激发的纳米传感器,用于细胞及肝脏缺血再灌注损伤组织中DNase酶活性的双光子成像分析。该探针基于DNase酶水解DNA的机制实现对DNase酶活性的检测,成功用于细胞及组织中DNase酶活性的检测及成像分析,并首次利用DNases作为窗口来探讨OCT在HIR过程中的肝保护作用。6.本章构建了一种双光子激发的SNA脱氧核酶（DNAzyme）荧光纳米探针用于活细胞中miRNA的成像分析。基于DNAzyme循环切割底物链放大信号的机制,该探针结合EBMVC和SNA的优势实现对细胞内微量miRNA的级联放大检测和成像分析。

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摘要

Abstract

第1章绪论

1.1 引言

1.2 上转换纳米颗粒

1.2.1 上转换纳米颗粒的基本概念

1.2.2 上转换纳米颗粒的合成策略

1.2.3 上转换纳米颗粒的表面修饰策略

1.2.4 上转换纳米颗粒的应用

1.3 双光子荧光材料

1.3.1 双光子吸收的概述

1.3.2 双光子荧光探针的应用

1.4 本文选题依据及拟开展工作

第2章新型上转换荧光纳米探针用于一氧化氮的检测及成像研究

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂和仪器

2.2.2 NO识别分子罗丹明B衍生物（RdMs）的合成

2.2.3 单取代β-环糊精对甲苯磺酸酯（β-CD-OTs）的合成

2.2.4 UCNPs的制备

2.2.5 UCNP@RdMMSN@βCD的制备

2.2.6 光谱数据的测定

2.2.7 细胞培养

2.2.8 细胞毒性和细胞成像

2.2.9 细胞裂解液的制备

2.2.10 组织成像

2.2.11 HIRI大鼠模型中NO的检测及成像

2.3 结果与讨论

2.3.1 UCNP@RdMMSN@βCD纳米复合探针的表征

2.3.2 UCNP@RdMMSN@βCD的稳定性和细胞毒性

2.3.3 UCNP@RdMMSN@βCD对 NO的响应考察

2.3.4 UCNP@RdMMSN@βCD在细胞及组织中的成像研究

2.3.5 UCNP@RdMMSN@βCD在 HIRI大鼠模型中的应用

2.4 小结

第3章新型上转换荧光纳米探针用于一氧化碳的检测及成像研究

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 化学试剂和仪器

3.2.2 CO识别分子（Pd-RdMs）的合成

2@Pd-RdMs@βCD的制备'> 3.2.3 UCNP@mSiO₂@Pd-RdMs@βCD的制备

3.2.4 光谱数据的测定

3.2.5 细胞毒性和细胞成像

3.2.6 组织成像

3.2.7 HIRI小鼠模型中CO的成像

3.3 结果与讨论

2@Pd-RdMs@βCD的制备及表征'> 3.3.1 UCNP@mSiO₂@Pd-RdMs@βCD的制备及表征

2@Pd-RdMs@βCD纳米探针的稳定性和传感性能考察'> 3.3.2 UCNP@mSiO₂@Pd-RdMs@βCD纳米探针的稳定性和传感性能考察

2@Pd-RdMs@βCD细胞摄取能力和细胞毒性的考察'> 3.3.3 UCNP@mSiO₂@Pd-RdMs@βCD细胞摄取能力和细胞毒性的考察

2@Pd-RdMs@βCD对活体细胞和组织切片中CO的成像分析'> 3.3.4 UCNP@mSiO₂@Pd-RdMs@βCD对活体细胞和组织切片中CO的成像分析

3.3.5 上转换纳米探针在小鼠体内的分布研究

2@Pd-RdMs@βCD对肝脏缺血再灌注损伤过程中CO的成像分析'> 3.3.6 UCNP@mSiO₂@Pd-RdMs@βCD对肝脏缺血再灌注损伤过程中CO的成像分析

3.4 小结

第4章新型上转换比率型荧光pH探针用于细胞成像分析研究

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 化学试剂和仪器

4.2.2 UCNPs的制备

2@βCD的制备'> 4.2.3 UCNP@DMI-mSiO₂@βCD的制备

4.2.4 光谱数据的测定

4.2.5 细胞毒性和细胞成像

4.2.6 组织切片双光子共聚焦荧光成像

4.3 结果与讨论

2@βCD纳米探针的制备及表征'> 4.3.1 UCNP@DMI-mSiO₂@βCD纳米探针的制备及表征

2@βCD对 pH的光学检测'> 4.3.2 UCNP@DMI-mSiO₂@βCD对 pH的光学检测

2@βCD对细胞内pH的成像研究'> 4.3.3 UCNP@DMI-mSiO₂@βCD对细胞内pH的成像研究

4.3.4 氧化还原物质对细胞或组织内pH的影响

4.4 小结

第5章双光子球形核酸纳米探针用于核糖核酸酶H的检测及成像研究

5.1 前言

5.2 实验部分

5.2.1 化学试剂和仪器

5.2.2 双光子SNA探针的制备

5.2.3 考察EBMVC与 DNA/RNA双链之间的结合常数

5.2.4 考察EBMVC/DNA/RNA复合物对RNase H酶活性的影响

5.2.5 双光子SNA探针的光谱实验

5.2.6 双光子SNA探针的选择性

5.2.7 双光子SNA探针的稳定性

5.2.8 细胞成像

5.2.9 流式细胞实验

5.2.10 细胞裂解液中RNase H酶活性的测定

5.2.11 肝组织中RNase H的成像分析

5.2.12 HIRI大鼠模型的构建

5.2.13 HIRI大鼠模型肝组织中RNase H的成像分析

5.2.14 HIRI大鼠模型肝组织中RNase H的 ELISA分析

5.3 结果与讨论

5.3.1 EBMVC的荧光性质及双光子球形核酸纳米探针的表征

5.3.2 传感平台可行性的验证

5.3.3 传感器的传感性能和细胞摄取

5.3.4 DNA/RNA SNA探针用于细胞及组织中RNase H酶活性的成像分析

5.3.5 肝缺血再灌注损伤模型中RNase H活性测定的探讨

5.4 小结

第6章双光子纳米探针用于缺血再灌注损伤体系中脱氧核糖核酸酶活性的检测及成像研究

6.1 前言

6.2 实验部分

6.2.1 化学试剂和仪器

6.2.2 双光子激发的纳米传感器AuNPs-dsDNA/EBMVC的制备

6.2.3 考察EBMVC与 dsDNA双链之间的结合常数

6.2.4 考察EBMVC/dsDNA复合物对DNase I酶活性的影响

6.2.5 AuNPs-dsDNA/EBMVC纳米探针的光谱实验

6.2.6 细胞毒性和细胞成像

6.2.7 流式细胞实验

6.2.8 HIRI大鼠模型肝组织中DNase的成像分析

6.3 结果与讨论

6.3.1 EBMVC和 EBMVC/dsDNA复合物的性质表征

6.3.2 AuNPs-dsDNA/EBMVC纳米探针的制备及表征

6.3.3 AuNPs-dsDNA/EBMVC纳米探针的优化

6.3.4 AuNPs-dsDNA/EBMVC纳米探针在缓冲液中对DNase I的光学响应

6.3.5 AuNPs-dsDNA/EBMVC纳米探针对细胞内DNase酶活性的成像研究

6.3.6 肝缺血再灌注损伤模型中DNase酶活性测定的探讨

6.4 小结

第7章双光子球形核酸酶纳米探针用于细胞内miRNA的检测及成像研究

7.1 前言

7.2 实验部分

7.2.1 化学试剂和仪器

7.2.2 凝胶电泳

7.2.3 SNA纳米探针的制备

7.2.4 体外荧光检测

7.2.5 SNA纳米探针的稳定性考察

7.2.6 荧光成像

7.2.7 细胞摄取和共定位

7.2.8 细胞内miR-21 的双光子成像分析

7.2.9 流式细胞分析

7.3 结果与讨论

7.3.1 脱氧核酶的优化

7.3.2 SNA纳米探针的制备与表征

7.3.3 SNA纳米探针用于miRNA的体外检测

7.3.4 细胞摄取和共定位实验

7.3.5 细胞内miRNA的双光子成像分析

7.4 小结

结论与展望

参考文献

附录攻读博士期间所发表的学术论文

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 王宁宁

导师: Chad A.Mirkin,李继山

关键词: 上转换纳米颗粒,双光子吸收,球形核酸,生物化学分子,细胞成像

来源: 湖南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学

单位: 湖南大学

分类号: O657.3;Q-334

DOI: 10.27135/d.cnki.ghudu.2019.000253

总页数: 160

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