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PEDV-TGEV-PRoV三联检蛋白质芯片方法的建立

2020-12-08阅读(285)

PEDV-TGEV-PRoV三联检蛋白质芯片方法的建立

论文摘要

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PRoV）是导致猪腹泻的三种主要病毒性病原,对各年龄段的猪都易感,尤其会造成幼龄仔猪极高的病死率,给我国以及世界上其他的养猪国家造成了巨大的经济损失。临床常发生这三种病毒的混合感染,相对于单一感染,对肠道的损伤更为严重。三种病毒感染后的临床症状和病理变化十分相似,给疾病的准确诊断和防控带来诸多困难。高效、快捷的病毒病原鉴定方法可以快速诊断疾病的病因,以便及时处置,减少疾病带来的损失。目前检测这三种病毒的方法主要有RT-PCR法、ELISA法和胶体金试纸条法,胶体金试纸条法快捷,但灵敏度低;ELISA法特异性好、灵敏度高、操作简单,但一次仅能检测一种病原;RT-PCR法虽然可实现3种病原的联检,但操作繁琐、耗时耗力、专业性强,易污染。因此,建立能同时检测并区分这三种病原的特异、敏感、快速、高效的检测方法对临床诊断具有重要意义。本研究拟应用蛋白质芯片技术,基于双抗体夹心检测抗原的原理,利用PEDV、TGEV、PRoV单克隆抗体作为捕获抗体和标记抗体,建立一种具有高度特异性、敏感性的高通量检测方法,为临床上PEDV、TGEV、PRoV所引起的猪病毒性腹泻疾病的鉴别诊断提供一种新的技术手段。首先复苏实验室前期制备的PEDV、TGEV、PRoV单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化,对纯度和浓度进行鉴定,同时对单克隆抗体进行HRP标记。基于单抗-抗原-酶标单抗的双抗体夹心原理,以变性硅胶膜为载体,利用制备的单克隆抗体构建PEDV-TGEV-PRoV三联检蛋白质芯片,并对三种病毒单克隆抗体的配对模式、芯片反应模式、捕获抗体最佳使用浓度、酶标抗体最佳稀释倍数、反应时间及显色时间等进行筛选,优化和确定蛋白质芯片的检测条件,并对蛋白质芯片的特异性、敏感性、重复性及方法学对照进行研究和评价。通过单克隆抗体配对筛选确定适合的捕获抗体分别为PEDV 8A3株单克隆抗体、TGEV 4B4株单克隆抗体、PRoV 3A8株单克隆抗体,酶标抗体分别为PEDV 12C4株单克隆抗体、TGEV 5H11株单克隆抗体和PRoV 3A8株单克隆抗体。捕获抗体最佳使用浓度分别为PEDV 8A3 0.8 mg/mL、TGEV 4B4 0.6 mg/mL、PRoV 3A8 0.6 mg/mL。酶标抗体最佳稀释倍数分别为PEDV 12C4 1:1500倍、TGEV 5H11 1:1500倍、PRoV 3A81:3000倍。反应模式为一步法,反应时间为45 min,显色时间为15 min。检测100份阴性临床样品确定判定阈值,PEDV为3392,TGEV为3147,PRoV为3936。检测PRV、PPV、PCV2、CSFV及PRRSV病毒液评价芯片特异性,结果均无交叉反应,特异性良好。检测3种病毒不同稀释倍数病毒液评价芯片灵敏度,结果对3种病毒的检测下限分别为PEDV 107.0TCID50/mL病毒液80倍稀释,TGEV 107.5TCID50/mL病毒液160倍稀释,PRoV 106.5TCID50/mL病毒液20倍稀释。评价批内、批间重复性均在15%以内,重复性较好。本研究建立了一种基于蛋白质芯片技术的快速检测PEDV、TGEV、PRoV方法,其进一步的完善与推广应用,对三种疾病的快速诊断和有效处置与防控具有重要的应用价值。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 文献综述
  •   第一章 猪病毒性腹泻研究进展
  •     1.1 猪流行性腹泻
  •       1.1.1 PEDV的分子生物学特征
  •       1.1.2 临床症状及病理变化
  •     1.2 猪传染性胃肠炎
  •       1.2.1 TGEV的分子生物学特征
  •       1.2.2 临床症状及病理变化
  •     1.3 猪轮状病毒病
  •       1.3.1 PRoV的分子生物学特征
  •       1.3.2 临床症状及病理变化
  •     1.4 猪病毒性腹泻的诊断方法
  •       1.4.1 临床诊断
  •       1.4.2 实验室诊断
  •   第二章 蛋白质芯片研究进展
  •     2.1 蛋白质芯片的原理
  •     2.2 蛋白质芯片的分类
  •     2.3 蛋白质芯片的应用
  •     2.4 研究的目的与意义
  • 试验研究
  •   第三章 PEDV-TGEV-PRoV三联检蛋白质芯片方法的建立
  •     3.1 材料
  •       3.1.1 病毒及病料
  •       3.1.2 主要试剂
  •       3.1.3 主要仪器
  •       3.1.4 主要试剂的配置
  •     3.2 方法
  •       3.2.1 单克隆抗体的制备
  •       3.2.2 单克隆抗体的纯化与标记
  •       3.2.3 蛋白质芯片的制备
  •       3.2.4 蛋白质芯片的操作步骤
  •       3.2.5 单克隆抗体的配对筛选
  •       3.2.6 蛋白质芯片反应条件的优化
  •       3.2.7 阈值的确定
  •     3.3 结果
  •       3.3.1 单克隆抗体的效价测定结果
  •       3.3.2 单克隆抗体纯化后浓度测定结果
  •       3.3.3 单克隆抗体HRP酶标结果
  •       3.3.4 单克隆抗体筛选配对结果
  •       3.3.5 蛋白质芯片捕获抗体稀释液的优化
  •       3.3.6 蛋白质芯片反应模式的优化结果
  •       3.3.7 蛋白质芯片捕获抗体浓度与酶标抗体浓度的优化结果
  •       3.3.8 蛋白质芯片反应时间的优化结果
  •       3.3.9 蛋白质芯片显色时间的优化结果
  •       3.3.10 阈值的确定
  •     3.4 讨论
  •     3.5 小结
  •   第四章 PEDV-TGEV-PRoV三联检蛋白质芯片方法学评价
  •     4.1 材料
  •       4.1.1 主要试剂
  •       4.1.2 主要仪器
  •     4.2 方法
  •       4.2.1 特异性检测
  •       4.2.2 灵敏度分析
  •       4.2.3 重复性检验
  •       4.2.4 临床样品检测
  •     4.3 结果
  •       4.3.1 特异性检测结果
  •       4.3.2 灵敏度分析
  •       4.3.3 重复性检验结果
  •       4.3.4 临床样品检测
  •     4.4 讨论
  •     4.5 小结
  •   结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 钟方粒

    导师: 王爱华

    关键词: 猪流行性腹泻病毒,猪传染性胃肠炎病毒,猪轮状病毒,蛋白质芯片,单克隆抗体

    来源: 西北农林科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 西北农林科技大学

    分类号: S852.651

    总页数: 61

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