张鹤令青海大学附属医院骨科810000【中图分类号】RV543+.18
【文献标识码】A【文章编号】1276-7808（2015）-04-422-01
结核病在我国有着长久的历史，是一种很早就被人类所认识的传染性疾病之一，也是一种常见病、多发病，曾一度被控制，但随着耐药菌株的出现、不合理用药等，近年来结核病的发病趋势又呈逐渐上升态势，再次对公共卫生构成严重威胁。2009年WHO报告在全球22个结核及耐药结核高负担国家中我国位列第二，仅次于印度[1]。2010年全国第五次全国结核病流行病学抽样调查报告显示，西部地区患病率明显高于中部和东部地区，乡村高于城镇，调查结果提示结核病疫情虽然有所下降，但结核病特别是耐药结核负担仍然很重[2]。非结核分枝杆菌（NTM）与结核分枝杆菌（TB）所引发的脊柱结核病例临床表现十分相似，但NTM对结核一线药物异烟肼和利福平等的不敏感率达到83.7%，而且目前在疑似结核病的临床病例中，非结核分枝杆菌感染所占比例高达11.1%，近年来研究发现致病性的NTM随着AIDS在全球迅速蔓延，同时陆续发现之前认为不致病的田鼠分枝杆菌可导致败血症，新金色分枝杆菌引起肺部感染，嗜血分枝杆菌引发眼内炎等，因此，在感染的早期快速准确的对分枝杆菌进行菌种鉴定对于疾病的诊断、治疗、控制具有重要意义。
目前常用的分枝杆菌菌种鉴定方法1.多重PCR（mutiplexPCR）：选用两对及以上的种、亚种或群特异性引物，扩增靶基因片段进行鉴定。有学者以IS6110、32kDa及mtp40为靶基因设计引物直接检测临床标本，48h内鉴定出MTC，同时也将MTB区分出来。但值得注意的是某些菌株缺乏IS6110或是mtp40可出现假阴性结果。以同一个基因为靶基因设计的两对以上引物扩增出不同的DNA片段也可以达到鉴别效果[3]。
2.PCR-限制性内切酶分析法（PCR-restrictionendonucle-aseanalysis，PRA）：先通过PCR扩增靶基因序列，产物经限制性内切酶消化，电泳后获得不同DNA图谱，进而鉴定菌种。一个多中心评价显示，以441bp的hsp65为靶基因扩增后采用BstEII和HaeIII限制性内切酶消化扩增片段鉴定了9种分枝杆菌，8个不同实验室鉴定的正确率差异较大，为44.4%~100%[5]。而有学者采用毛细血管电泳限制性分析法仅用HaeIII酶就能鉴定12种分枝杆菌，包括堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌，鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌，耻垢分枝杆菌和草分枝杆菌及龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌。
3.PCR-基因缺失分析（PCR-basedgenomicdeletionanalysis，PCR-GDA）：比较基因组分析结核分枝杆菌H37Rv全基因组序列后发现，有16个区域（RDI-RD16）在MTC成员中缺失存在差异。据此应用PCR技术探查基因组差异的区域是否存在，通过特定的缺失图谱可区别MTC各成员。有研究者应用此项技术分析了88株MTC菌株，除了非洲分枝杆菌外其他的鉴定结果正确率可达100%。对于初步筛选，扩增RD1、RD9、RD10足够，初筛阴性者可再用RD3、RD5、RD11。与前述及后面提到的方法相比，该方法最突出的优点是可以简单快速的鉴别MTC成员，特别是牛分枝杆菌和MTB。
4.随机扩增多态性DNA（randomlyamplifiedpolymorphicDNA，RAPD）：原理是用一条8~12bp的人工合成寡核苷酸引物对整个DNA链进行探查，在较低温度下与匹配或部分匹配的退火位点结合，扩增出呈现多态的DNA片段，经电泳后可得到DNA指纹图谱，进而进行菌种鉴定。此方法对标本要求不高，简单快速，成本较低，且又无需预知靶DNA序列。但应用该技术时需注意模板应采用同一方法制备，模板浓度要合适，退火温度需要较低（25~40℃），而扩增条件的优化组合非常关键。
5.核酸探针杂交（nucleicacidprobehybridization）技术：（1）反向斑点杂交技术（reversedotblothybridization，RD-BH）及反向线点杂交技术（reverselineblothybridization，RLB）：原理是标记的PCR扩增产物与载体上的属及种特异的寡核苷酸探针杂交后，通过显影系统判定结果。吴雪琼等以16SrRNA为靶基因采用RDBH成功鉴定了22种分枝杆菌，与DNA测序相比准确率为99.1%。1株亚洲分枝杆菌和1株新金色分枝杆菌通过RDBH没有被鉴定出来，因膜上没有相应的探针[6]。
（2）DNA微阵列（DNAmicroarray）huoshi基因芯片（GeneChip）基于反向杂交技术：将大量靶基因探针高密度排列固定于一块特殊处理的载体上，标记的PCR产物与载体上的探针进行杂交，以特定仪器检测杂交信号而对细菌进行鉴定。以ITS为靶序列Heekyung等采用寡核苷酸阵列从临床分离菌株及临床样本中成功鉴定了19种临床上重要的分枝杆菌[7]，同时结合微电子阵列，可达到需样本量少、准确、信噪比极小且易于操作，得益于芯片技术的优势，灵敏、准确且简便可靠，同时可检测多种靶基因，进行高通量、平行性、集成化、微型化、自动化和多样化检测。
目前，结核感染防控面临两大问题：一是结核多药耐药（MDR）的产生与传播，使结核分枝杆菌感染难以控制，再度发展为难治倾向，MDR是结核病高病死率的主要原因之一。二是非结核分枝杆菌（NTM）所引发的疾病发病率增加，越来越为人们所关注。NTM病与结核病无临床特异性，耐药性高，致病菌种繁多，快速诊断结核病和常见各种非结核分枝杆菌非常重要。目前结核杆菌感染鉴别诊断和结核耐药检测是通过痰液（或其他样品）培养出结核分枝杆菌，然后作生化鉴定或测序来进行菌种鉴定，对于耐药则需要传统的药敏试验，需要6到8周的时间，延误了病人的早期治疗，使病人处于盲目用药状态。
基因芯片法与传统检测方法相比，检测时间短、通量高。分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（DNA微阵列芯片法）可以快速检测结核、鸟、胞内、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬等17种临床常见分枝杆菌，将常规的检测时间由6到8周缩短为6小时，极大提高了检测的效率，具有很好的社会效益。
参考文献：[1]骆科文欧维正张廷梅等.基因芯片技术快速检测结核分支杆菌和药敏试验及菌种鉴定的临床应用研究[J].贵州省预防医学会2014年学术年会暨传染病预防控制与公共卫生人才培养论坛论文集，2014，S316-S324.[2]王宇2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告《中国防痨杂志》2012年第34卷第8期485-508.[3]KimBJ，HongSK，LeeKH，etal.DifferentinalIdentificationofMycobacteriumtuberculosisComplexandNontuberculousMycobacteriabyDuplexPCRAssayUsingtheRNAPolymeraseGene（rpoB）.JClinMicrobiol，2004，42：1308-12.[4]TasaraT，HoelzleLE，StephanR，DevelopmentandevaluationofaMycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosis（MAP）specificmultiplexPCRassay.IntJFoodMicrobiol，2005，104：279-87.[5]LeaoSC，BemardelliA，CataldiA，etal.MulticenterevaluationofmycobacteriaidentificationbyPCRrestrictionenzymeanalysisinlaboratoriesfromLatinAmericaandtheCaribbean.JMicrobiolMethods，2005，61：193-199.[6]WuX，ZhangJ，LiangJ，etal.Comparionofthreemethodsforrapididentificationofmycobacterialclinicalisolatestothespecieslevel.JClinMicrobiol，2007，45：1898-1903.[7]ParkH，JangH，SongE，etal.DetectionandGenotypingofMycobacteriumSpeciesfromClinicalIsolatesandSpecimensbyOligonucleotideArray.JClinMicrobiol，2005，43：1782-1788.