李勇[1]2004年在《大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及BMP2在诱导其向神经元样细胞分化中的作用》文中认为骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有高度的增殖和自我更新能力,并可分化为多种不同类型组织细胞。多年来,人们对骨髓的研究主要集中在造血干细胞上,并取得了可喜的成果。骨髓间充质干细胞一度被认为主要对造血干细胞的生长、增殖和分化起营养和支持作用,所以又称之为骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells)。而近年来,随着研究的深入,骨髓间充质干细胞的作用逐渐被拓展,人们发现骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,能够在一定条件下分化为包括神经细胞和胶质细胞在内的多种成体细胞。骨髓中这种非造血干细胞是中胚层来源的未分化细胞,目前已成功建立了一套较完整的体外培养扩增体系,并证实经有关化学物质诱导,MSCs在体外可以分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、肝细胞、血管内皮细胞、神经细胞、星形胶质细胞等细胞类型。应用自体或异体细胞来取代、修复或加强受损组织、器官或系统生物学功能的治疗方法称之为细胞治疗。随着对骨髓MSCs研究的深入,MSCs在细胞治疗上所具有的潜在应用价值逐渐被人们认识。通过自体或异体移植MSCs进行细胞治疗,许多目前难以治疗的疾病如帕金森氏病和阿尔海默茨病等困扰老年人的疾病将可能被攻克。在神经系统外伤、手术后遗症、缺血性或出血性等疾病中也同样具有很大的潜力。但在体的MSCs迁徙分化不容易被控制,所以体外诱导MSCs分化的研究将为临床移植提供必要的理论依据和治疗基础。在神经系统疾病中,系统功能受到损害,现行的药物治疗、介入治疗和基因治疗对部分病人并不能取得满意的疗效。研究发现MSCs在体内及体外试验中,均可以向神经元样细胞或胶质样细胞分化。这为临床治疗带来新的希望。目前已应用于临床的胚胎干细胞移植存在取材、伦理、法律及免疫排斥等多种问题,这些缺陷限制了它在临床上的应用。而对于MSCs来说,则不存在上述困扰,其优点显而易见。首先MSCs来源广泛,间叶组织来源的很多组织器官已经发现MSCs的存在;其次取材方便,通常可取自自体骨髓,简单的骨髓穿刺就可获得;另外由于细胞取自自体,应用其诱导分化而来的组织细胞进行移植不存在组织配型及免疫排斥的问题;分化较容易,虽然体外诱导条件较难控制,但其环境依赖性很强,容易接受
许永涛[2]2009年在《胰岛素样生长因子诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化》文中进行了进一步梳理目的:1.体外探讨分离与培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的方法,并观察其体外的多向分化与增殖能力以及其生物学特性,还对细胞表面干细胞相关标志物进行鉴定,为骨髓间充质干细胞的进一步研究奠定基础。2.探讨胰岛素样生长因子和多种细胞因子联合诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化的可行性,实验条件。并用激光共聚焦显微镜观察分化细胞的阳性率,及形态学变化寻找最佳的诱导条件,为获得大量少突胶质细胞移植修复脊髓损伤奠定基础。3.在实验二的基础上,观察骨髓间充质干细胞的增殖分化过程,判断IGF-1在少突胶质细胞分化中的那个环节起作用,寻找胰岛素样生长因子和多种细胞因子联合诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化的作用机制,并给予一定的干预措施,进一步予以证实。方法:1.取原代细胞后,用贴壁筛选法和胰蛋白酶消化法分离纯化,倒置相差显微镜观察细胞形态及生长特征,研究其增殖过程,绘制出生长曲线,采用免疫组化法对细胞表面干细胞标志CD44进行鉴定,对第4代细胞分别用成骨,成软骨,成脂肪和成神经诱导剂培养,行碱性磷酸酶染色,Van kossa银染色法,Ⅱ型胶原免疫组化染色,油红O染色,NeuN抗体免疫组化染色以及形态学观察,证实其干细胞的多向分化潜能。2.选取生长良好的第4代骨髓间充质干细胞,胰酶消化后,离心加入诱导液,转移至含有盖玻片的培养皿中,细胞数为1×10~4个/cm~2,放入体积分数为0.05的CO_2孵箱中培养48h后,诱导组细胞更换培养液,用含不同浓度IGF-1的分化培养液培养3d后,观察骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞诱导分化过程中的形态学变化,收取细胞进行特异性标志物大鼠磷脂碱性蛋白(MBP)、半乳糖脑苷脂(Glac)、半定量RT-PCR(semi-quatitative reverse transctiption-polymerase chain reaction)检测,Western-blot测定大鼠磷脂碱性蛋白(MBP)含量,免疫细胞化学染色后激光共聚焦显微镜检测骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化的阳性率。并筛选出最佳IGF-1(Insulin growthfactor-1)浓度剂量的分化培养液。3.根据BMP2(bone morphogenetic proteins)在少突胶质细胞的形成中起抑制作用,少突胶质细胞的成熟需要BMP信号的抑制剂,为了获得IGF—1诱导少突胶质细胞分化的分子机制,我们推断IGF—1的影响是通过抑制BMP2信号通路。我将分化培养液中加入不同剂量的BMP2培养3天,收取细胞进行特异性标志物大鼠磷脂碱性蛋白(MBP)、半乳糖脑苷脂(Glac)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管相关蛋白—2 (MAP-2)半定量RT-PCR检测,并进行统计学处理,免疫细胞化学染色后激光共聚焦显微镜检测骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化的阳性细胞百分比。结果:1.所分离培养的细胞形态呈长梭形或多边形,细胞生长曲线呈S形,群体倍增时间约为31小时,经成骨诱导剂诱导培养2周后,碱性磷酸酶染色成阳性,Van kossa银染色法阳性表明该细胞可向成骨方向分化,经成软骨诱导剂诱导培养2周后,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,表明该细胞可向成软骨方向分化,而分离培养的细胞经成脂肪诱导剂诱导培养2周后,油红O染色可见显微镜下大量细胞内充满红色脂肪滴,表明该细胞可向脂肪细胞方向分化,所培养的细胞经化学性神经诱导剂诱导培养8小时后,NeuN抗体免疫组化染色阳性,细胞呈神经元样形态表现,表明该细胞可向神经细胞方向分化。MSCs抗原CD34免疫细胞化学染色呈阴性反应,CD44免疫细胞化学染色见镜下有棕黄色颗粒沉积。以上结果提示,用贴壁筛选法所分离培养的细胞为具有多向分化潜能的大鼠骨髓间充质干细胞。2.①骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞诱导分化过程中的形态学变化:经诱导分化后,大部分骨髓间充质干细胞表现出少突胶质细胞的形态学特征,胞质向细胞核回缩,细胞突起向外延伸,折光性增强,随时间延长多个细胞突起相互连接形成典型的网状结构。②少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达:细胞诱导分化后可检测到磷脂碱性蛋白mRNA、半乳糖脑苷脂mRNA的特异性条带。③少突胶质细胞阳性率:在诱导分化条件下,半乳糖脑苷脂阳性率为65%,磷脂碱性蛋白阳性率为45%,微管相关蛋白2阳性率为10%。比较含不同IGF-1浓度的分化培养液,发现含500μg/L IGF-1浓度的培养液少突胶质细胞标志物阳性率最高。④Western-blot检测磷脂碱性蛋白表达水平明显增高,以含500μg/L IGF-1浓度的培养液分化组最为明显。3.在分化培养液中加入不同浓度的BMP2,发现向少突胶质细胞的分化明显受到抑制,仅部分骨髓间充质干细胞表现出少突胶质细胞的形态学特征,与BMP2的浓度成依赖关系,浓度越高(5μg/L)少突胶质细胞标志物(Glac,MBP)的阳性细胞越少,收取细胞进行特异性标志物大鼠磷脂碱性蛋白(MBP)、半乳糖脑苷脂(Glac)半定量RT-PCR检测,未检查出特异性条带。在低浓度(0.05μg/L—0.5μg/L)的情况下,可以观察到部份细胞向少突胶质细胞分化,这个结果与BMPs抑制少突胶质分化的特性相一致。结论:1.通过取大鼠骨髓组织培养,用贴壁筛选法和胰蛋白酶消化法分离纯化,可以分离出稳定的含CD44抗原的有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞,该细胞不断可以向中胚层成细胞分化,而且可以向外胚层神经细胞分化,取材方便,容易获得是体外研究干细胞定向分化的理想细胞。2.合适的培养基和一定浓度的IGF-1有利于骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化,该结果通过探讨诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化的可行性,实验条件,为以后的间充质干细胞向少突胶质细胞的定向分化移植治疗脊髓损伤打下基础。3.胰岛素样生长因子诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化,其主要作用机理是通过抑制少突胶质细胞前体在脊髓中特异化的抑制性因子BMPs的信号通道,促进少突胶质细胞的产生。
张科强[3]2008年在《冲击波诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的机制》文中研究说明随着骨组织工程研究的不断发展,种子细胞的来源、培养、诱导、增殖、分化等研究成为近年来骨组织工程进行研究的热点。间充质干细胞具有能大量增殖、分化为多种组织细胞和表达外源目的基因等优点,并且可以在特定的条件下定向向成骨细胞分化,因其可能成为用于临床的组织工程化骨种子细胞而受到越来越多的关注。近年来体外冲击波疗法正被广泛的用于治疗骨不连、骨折延迟愈合和股骨头坏死以及运动系统慢性劳损性疾病,并取得了很好的疗效。人们发现,机械物理刺激促使间充质干细胞分化。冲击波作为一种机械物理刺激能够促使间充质干细胞向成骨细胞分化,但这一过程不是自发完成的,其中可能涉及到多条信号通路的调控,其中MAPK通路可能起着极其重要的调节作用,但具体通过MAPK传导路途径的ERK、JNK以及p38MAPK通路中哪一条通路参与以及各通路在诱导成骨分化过程中的作用尚不十分清楚。本试验通过前期获得最佳冲击波(工作电压为8.5kv,作用频次为120次)作用于分离培养后的人骨髓间充质干细胞,设立空白对照组,并分别加入ERK、JNK以及p38MAPK通路抑制剂,通过western blot检测ERK、JNK以及p38MAPK的磷酸化以及MAPK通路作用底物AP-1(c-fos和c-jun mRNA)的表达。用MTT法检测细胞增殖,用成骨特性鉴定的方法(钙-钴法染色检测碱性磷酸酶的表达及其活性、Von Kossa染色检测钙结节和钙沉积量的检测)判断冲击波是否诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,研究ERK、JNK、p38 MAPK通路在体外冲击波诱导下人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中的作用。本研究发现在冲击波诱导人骨髓间充质干细胞诱导向成骨细胞分化过程中,通过Western blot方法证实ERK、JNK以及p38MAPK通路均早期磷酸化激活,提示ERK、JNK以及p38MAPK通路均参与了成骨细胞增殖、分化。应用ERK、JNK以及p38MAPK通路相应的阻断剂研究结果表明:ERK通路促进人骨髓间充质干细胞增殖,抑制ERK通路后细胞增殖作用明显降低。抑制JNK通路后向成骨细胞分化作用虽有降低,但不具有统计学意义;对细胞增殖未见有明显作用。抑制p38MAPK通路后MAPK作用底物AP-1 (c-fos和c-jun mRNA)表达明显受抑制,成骨鉴定证实向成骨细胞分化作用明显降低,并呈剂量依赖性;低浓度的p38MAPK抑制剂反而促进细胞增殖。应用阻断剂后行同样条件进行诱导,提示p38MAPK通路是冲击波诱导人骨髓间充质干细胞诱导向成骨细胞分化的主要途径。
行勇军[4]2016年在《神经嵴来源外胚间充质干细胞在牙向分化中的潜能及相关机制的研究》文中认为长期以来,因龋病、牙周病、创伤等原因造成的牙齿缺失对人类造成较大的困扰,包括种植牙在内的各种缺失牙修复方法各有其局限,尚不能完全恢复缺牙患者的生理和心理功能。牙组织工程和牙再生医学的出现提供了一条更为适宜的思路,即重新启动牙齿发育进程,以修复牙体、牙周组织缺损,直至全牙再生。在牙组织工程中,适宜种子细胞的选择是组织工程叁要素中最为重要的内容。神经嵴来源的外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells,EMSCs)和外胚层来源的上皮细胞的连续相互作用贯穿于牙形态发生的始终。在经典的牙发育理论中,牙齿的发生是由这两个胚层细胞经复杂的上皮-间充质相互作用,并伴随着按严格时-空顺序表达的信号分子“瀑布”调控完成的。在胚胎发育早期,神经嵴细胞从中、后脑的神经嵴经上皮-间充质转化、脱层后迁移至第一腮弓,并组成第一腮弓的大部分组织,此时称为外胚间充质干细胞。牙板形成后,牙齿发育开始启动,牙板上皮来源的信号分子传递至其下方神经嵴来源的EMSCs,引起其增殖、凝聚,经牙板期、蕾状期、帽状期和钟状期等明确的牙齿发育阶段,在釉质形成后,牙根发育启动并最终萌出至咬合平面,完成牙齿的发育。在这一过程中,神经嵴来源的EMSCs形成了除牙冠釉质外全部牙体组织结构,包括其派生的牙乳头间充质细胞,其最终分化为成牙本质细胞并分泌基质,形成牙髓-牙本质复合体、以及其派生的牙囊祖细胞(dental follicle progenitor cells,DFPCs)最终形成的牙骨质、牙周膜和部分根周牙槽骨等。由此可见,牙齿发育早期的EMSCs具有双向分化特性,即向成牙本质细胞和牙囊祖细胞及其子代细胞分化的特性,理论上EMSCs作为牙组织工程的种子细胞,具有形成除釉质外牙齿全部结构的能力。但这一胚胎发育过渡性的干细胞在体外诱导环境下,是否具有牙向分化能力,尚待进一步明确。再者,目前牙发育相关研究表明,尚有非神经嵴来源的间充质参与牙形态发生,牙组织工程相关研究也提示,除了神经嵴来源的牙齿间充质干细胞,非神经嵴来源的间充质干细胞,如骨髓间充质干细胞等也可表达牙向分化能力。神经嵴源性和非神经嵴源性的间充质干细胞作为牙组织工程的种子细胞,哪一个更为适宜,尚无明确定论。因此,目前有叁个亟待解决的问题:(1)神经嵴来源的EMSCs在体外牙向诱导环境下是否具有牙向分化能力?(2)神经嵴来源的emscs作为种子细胞,和非神经嵴来源的间充质干细胞比较,其成牙潜能如何?(3)牙胚的发生是通过口腔上皮与颅颌神经嵴来源emscs细胞间的信号分子网络调控、进而推动的复杂发育过程,而胚胎发育早期emscs参与牙齿发育的内在分子调控机制尚待进一步明确。因此,研究牙发育早期emscs的成牙潜能和内在分子机制,可以为完善牙发育学理论,以及为牙组织工程的种子细胞选择和构建组织工程牙胚,提供初步的依据和策略。主要研究内容和结果目的:本课题主要对比研究大鼠胚胎11.5d(e11.5d)第一腮弓神经嵴来源的emscs和非神经嵴来源的emscs,在体外、体内成牙诱导微环境下的成牙潜能差异;利用细胞凝聚技术还原牙齿器官发育模式,从上皮-间充质相互作用和牙发育角度探讨明确的神经嵴来源的emscs在体外、体内的牙向分化模式;进一步以基因芯片技术探讨神经嵴来源的emscs在牙向分化过程中可能存在的分子机制,为牙发育机制和牙组织工程再生提供可能的理论依据和策略。方法:1.为明确p75-ntr标记的emscs在牙发育中的时空变化,我们通过对e11.5-e18.5d大鼠胚胎牙齿不同发育阶段的连续观察,利用he和ihc技术对比观察神经嵴细胞的标记物,p75神经营养因子受体(p75-neurotrophinreceptor,p75-ntr)以及胚胎干细胞标记物oct4和sox2,在牙发育各个时期emscs中的时空表达和生物学功能;2.为获取明确的神经嵴来源的emscs,我们以流式细胞技术分选e11.5d大鼠胚胎第一腮弓来源的p75-ntr阳性emscs(p_(75)~+emscs),原代细胞培养后进行增殖能力检测和干细胞鉴定;3.为明确p_(75)~+emscs是否具有牙向分化能力,及探讨与非神经嵴来源的p75-ntr阴性emscs(p75-emscs)的牙向分化能力差异,我们利用大鼠切牙颈环上皮干细胞系hat-7条件培养液和切牙颈环上皮干细胞,通过体外、体内诱导模式对p75进行牙向分化诱导。体外诱导模式下以hat-7条件培养液诱导0、4、8、12d后观察细胞形态变化,透射电镜(tem)检测诱导前后的细胞超微结构变化,流式细胞术检测细胞周期变化;对比p75和蛋白dsp、dmp1等变化;体内诱导模式下,以原代大鼠切牙颈环上皮干细胞重组p_(75)~+emscs/p75-emscs(细胞比例2:3),以i型胶原蛋白为重组体支架,待细胞自发凝聚后,大鼠肾被膜下移植,4周后取材进行ihc鉴定成牙关键蛋白dsp和dmp1表达;4.为进一步探讨神经嵴和非神经嵴来源的emscs牙向分化差异的分子机制,我们以基因芯片微阵列分析e11.5dp_(75)~+emscs和p75-emscs基因表达谱差异基因,kegg代谢通路分析牙发育相关信号通路。然后以sirna-smad4沉默p_(75)~+emscs的tgf-β信号通路关键蛋白smad4,smad4激活剂kartogenin激活p75-emscs的smad4表达,以上两组细胞在hat-7条件培养液牙向分化诱导后,以westernblot检测tgf-β信号通路关键蛋白smad4对p_(75)~+emscs和p75-emscs牙向分化能力的影响。结果:1.p75-ntr作为公认的神经嵴细胞的标记物,在牙齿各个发育时期的牙源性间充质中都连续表达,可以作为神经嵴来源的emscs的连续标记物。其同时在牙上皮表达,显示其参与了上皮和间充质的相互作用;胚胎干细胞的标记物oct4和sox2的表达在牙发育早期表达较弱,在牙发育后期(钟状期)的上皮-间充质界面强烈表达,显示其协同p75-ntr调控上皮-间充质相互作用;2.分选前emscs形态具有高度异质性,显示不同族群的细胞杂居生长。分选后的p_(75)~+emscs呈短梭叁角形,形态趋于一致。p_(75)~+emscs分选比率为24.5%提示其在第一腮弓组织中有较高的比率。细胞增殖实验显示p_(75)~+emscs的增殖能力显着高于p75-emscs。免疫荧光鉴定p_(75)~+emscs具备间充质干细胞表面抗原(stro-1、vimintin)和神经嵴细胞(p75-ntr,ap2α,hnk-1)双重标记物,同时胚胎源性标记物oct4阳性,提示为具有神经嵴源性和间充质干细胞双重特性的外胚间充质干细胞(emscs);3.p_(75)~+emscs在体外成牙诱导模式下细胞形态、细胞周期、细胞增殖、细胞超微结构变化以及高表达成牙本质细胞标记物dspp(dsp)和dmp1,证实细胞分化为具有分泌功能的成牙本质细胞样细胞。p_(75)~+emscs的成牙本质细胞标记物dspp和dmp1的mrna显着高于p75-emscs。体内在牙源性上皮干细胞的诱导下,p_(75)~+emscs呈一定层次围绕岛型牙源性上皮,强烈表达dsp和dmp1,而p75体外、体内两种成牙诱导模式下证实,p75p75-emscs;4.对比p75≥1.5),kegg代谢通路分析显示涉及多个信号通路,其中tgf-β信号通路与牙齿发育密切相关。在差异基因中,smad4是tgf-β信号通路中的关键节点。westernblot和Real-time PCR的结果也证实P_(75)~+EMSCs的Smad4表达水平显着高于P75-EMSCs。P_(75)~+EMSCs经特异性的si RNA-Smad4沉默后,其成牙能力相应受到抑制,而P75-EMSCs经smad4激活剂激活后,其成牙能力显着增加。这一结果表明,P_(75)~+EMSCs较P75-EMSCs具有更为活跃的成牙分化潜能的机制,可能在于其通过smad4介导的TGF-β信号通路实现。结论:综上所述,E11.5d大鼠胚胎腮弓来源的P_(75)~+EMSCs作为明确的神经嵴来源的外胚间充质干细胞,对比非神经嵴来源的P75-EMSCs,在体外和体内两种成牙诱导模式下都显示更为活跃的牙向分化潜能。这一能力可能是通过Smad4为核心的TGF-β/Smad4信号通路介导获得的。P_(75)~+EMSCs有希望作为一种新的干细胞资源,为研究完善牙发育理论,以及牙组织工程和牙再生医学提供帮助。
华松[5]2004年在《山羊骨髓间充质干细胞体外分离与培养》文中研究指明骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cell ,BMSC）是存在于骨髓中的除造血干细胞以外的另一类具有多向分化潜能的干细胞。具有贴壁生长的特性，在体外易分离和扩增，在一定的诱导条件下，这类细胞可定向分化为多种造血以外组织,特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞，还易于外源基因的转入和表达，在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞。人骨形成蛋白2（ human bone morphogenetic protein 2，hBMP-2 ）属于转化生长因子β超家族中的一员，是最理想的诱骨因子，可以诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地分化为软骨细胞和成骨细胞,进而形成新骨的能力，当植入非骨组织时，能异位诱导成骨，在骨折和骨损伤修复过程中发挥着重要作用。BMP基因在生物进化过程中高度保守，种属间差异小，不同脊椎动物的BMP具有高度的同源性。 本研究基于细胞工程与转基因技术相结合，把诱骨因子hBMP-2基因整合到靶细胞BMSC中，再将BMSC植入骨损伤处，让hBMP-2基因在体内稳定地表达，从而达到hBMP-2基因基因治疗的目。所作的工作如下：1．采用密度梯度离心（Percoll分离液）法将BMSC从山羊骨髓血液中分离出来，置于低糖DMEM中进行传代培养。利用换液的方法对其纯化，接种两小时后开始贴壁，贴壁生长的细胞呈典型的成纤维细胞样外观。原代与传代培养细胞的生长曲线都为S型，但是传代培养的细胞生长速度比原代快。传代培养的结果显示，在经历了9代培养以后，山羊BMSC才出现衰老征象。与原代培养细胞的生长曲线相比，传代培养的细胞生长潜伏期短，每代只要9天就可铺满培养皿底壁。2．参考上皮细胞的冷冻方法，用含不同浓度的血清和DMSO的冷冻液进行冷冻，以解冻后的细胞贴壁率为标准，筛选理想的冷冻液。发现冻存液DMEM＋10％FBS+10%DMSO与DMEM+15%FBS+10%DMSO对山羊BMSC的冷冻有着相同的效果，因此选择DMEM+10%FBS+10%DMSO为山羊BMSC的冷冻液。3．取P1、P5和P9代细胞制备细胞爬片，用β-巯基乙醇/当归注射液分别对其进行定向诱导，每隔30min在光学显微镜下观察细胞形态变化，用免疫组织化学鉴定。结果表明β-巯基乙醇和当归注射液对山羊BMSC有同样的诱导效果，两种方法诱导后的细胞70%以上表达神经丝蛋白（NF）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）。说明山羊BMSC同样可以被诱导成为神经样细胞，同时也说明了采用Percoll分离液进行梯度密度离心后分离的细胞为BMSC。4．采用TRIZOL法从人胎盘组织中提取总RNA，通过RT-PCR方法获得编码hBMP-2的基因，重组到pMD-18T载体上后在大肠杆菌中克隆，经检测，所获得的基因序列与基因文库中hBMP-2基因同源性为99.9%，即成功的克隆出了hBMP-2基因，为进一步研究hBMP-2基因在BMSC中的高效表达奠定了基础。
刘颖[6]2006年在《转染mIFNγ的骨髓间充质干细胞治疗大鼠胶质瘤的实验研究》文中指出胶质瘤是常见的原发性脑肿瘤,占颅内原发肿瘤的一半以上,易复发,难治愈。胶质瘤具有迁移特性,迁移的微小病灶通过常规手术和放化疗难以根除。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨髓中除造血干细胞以外的另一类干细胞,是一群具有多向分化潜能的细胞。BMSCs的多向分化潜能,尤其是它向神经细胞分化的能力,可修补受损脑组织;此外,BMSCs还具有向胶质瘤迁移能力,给本研究提供了一个理想的基因治疗胶质瘤的载体。胶质瘤患者的免疫功能低下与IFNγ有关,不仅患者外周血淋巴细胞IFNγ分泌不足,而且胶质瘤细胞中IFNγ基因也呈劣势表达;此外,胶质瘤细胞分泌的免疫抑制因子也通过下调T淋巴细胞表达IFNγ,从而抑制T淋巴细胞功能。本实验将分子生物学技术与形态学手段相结合,利用转基因技术在国内、国外首次将mIFNγ基因通过携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的逆转录病毒载体导入大鼠的BMSCs,在体内、体外观察转染mIFNγ基因的BMSCs治疗胶质瘤的情况。结果证明,BMSCs可向胶质瘤细胞迁移,并可分化成MAP-2或GFAP阳性细胞;转染mIFNγ基因的BMSCs在体内外均可抑制大鼠胶质瘤细胞生长,延长大鼠生存期。
侯秋科[7]2010年在《维生素D受体介导龟板诱导的骨髓间充质干细胞向成骨分化》文中进行了进一步梳理一、研究目的骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells, MSCs)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞,在不同诱导条件下,具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞及骨髓基质等组织细胞分化的潜能。由于MSCs具有易分离、扩增以及体外操作简便、体内免疫反应较弱等特点,在临床上有广泛的应用前景。但是由于骨髓间充质干细胞分化能力不强,诱导其高效率单一分化是我们亟需解决的问题。龟板入肝肾经,具有滋补肝肾,益肾填精之效。研究表明龟板含药血清在不同时间可以促进MSCs的增殖和分化,这种作用和BMP4激活不同的受体有关。中医“肾主骨生髓”的理论为指导依据,我们前期的实验已发现MSCS在龟板含药血清诱导作用下,可向成骨细胞方向分化,表现为碱性磷酸酶(ALP)活性升高。龟板的化学成分复杂,其中发现龟板的乙酸乙酯部位作为洗脱剂分离出来的成分含有与成骨诱导剂地塞米松类似的甾类成分,此成分与成骨分化有着密切的联系。核受体(nuclear receptor,NR)是配体依赖性转录因子超家族,与机体生长发育、细胞分化、体内许多生理、代谢过程中的基因表达调控密切相关。针对不同的刺激信号,核受体与不同辅助调节因子的相互作用从而激活或抑制下游基因的表达。BMP能诱导成骨细胞和软骨细胞的分化成熟,作为下游基因,受到核受体的支配,当受到核受体信号后,并能在体内诱导异位成骨。BMPs与骨形成蛋白受体BMPR结合,通过Smads和MAPKs途径进行信号转导,并通过下游转录因子Cbfal等与相应的成骨细胞特异蛋白碱性磷酸酶、骨钙素、OPN等基因启动子链接,促进细胞向成骨方向分化。本课题以核受体为突破口,探讨龟板提取物对骨髓间充质干细胞成骨分化过程中核受体的影响。本实验目标在于确定龟板提取物诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨分化和对核受体中维生素D受体的影响及通路BMP的表达情况。二、实验方法和内容首先体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,分别用龟板提取物,成骨诱导液诱导MSCs向成骨分化,空白对照不加任何处理因素,诱导七天后,通过免疫化学染色、Western blot、原位杂交、RT-PCR等方法观察龟板提取物对原代培养的MSCS向成骨分化的成骨分化标记物ALP、OPN及VDR、VDR mRNA的表达情况。为了更进一步研究,本实验采用EndoFectinTM-Plus试剂瞬时转染VDR的表达质粒,一方面,观察转染后Vonkoss染色结果；另一方面,提取转染后的MSCs细胞蛋白,运用Western blotting观察龟板提取物对MSCS向成骨分化的成骨分化标记物ALP、OPN等及BMP通路相关蛋白的表达情况。用同样的转染方法,对VDR基因沉默。一方面，观察VDR基因沉默后Vonkoss染色结果；另一方面,提取VDR基因沉默后的MSCs细胞蛋白,运用Western blotting观察龟板提取物对原代培养的MSCs向成骨分化的成骨分化标记物ALP、OPN等及BMP通路相关蛋白的表达情况。叁、实验结果未转染VDR表达质粒及未进行VDR基因沉默时,免疫组化染色显示龟板组成骨分化标记物ALP、OPN和VDR的阳性百分比明显高于对照组；Western blot结果也显示龟板组的ALP、OPN和VDR的蛋白表达水平高于对照组；同时原位杂交、RT-PCR提示了龟板诱导MSCs向成骨分化过程可促进VDR mRNA的表达。转染VDR表达质粒后,Vonkoss染色结果显示细胞呈复层生长,并形成钙化结节,Western Blotting显示VDR转染后VDR的表达明显增加,成骨标记物ALP、OPN、RunX2、CollagenⅠ明显高于转空载体组,BMP通路相关蛋白BMPRIB、BMPRIA、BMPR-ⅡBMP4、SMAD5、P-Smadl/5/8的表达高于转空载体组。VDR基因沉默后,Vonkoss染色很难找到钙化结节存在,Western Blotting显示VDR基因沉默后VDR的表达明显降低,成骨标记物ALP、OPN、RunX2、CollagenⅠ明显低于转空载体组,BMPs通路相关蛋白BMPRIB、BMPRIA、BMPR-ⅡBMP4、SMAD5、P-Smad1/5/8的表达低于转空载体组。四、结论龟板提取物可促MSCs向成骨分化,其过程可能与VDR的上调有关。VDR过表达质粒有协同龟板提取物促进骨髓间充质干细胞向成骨分化的作用。VDR基因沉默抑制了龟板提取物诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化的效应。得出结论：维生素D受体介导龟板诱导的骨髓间充质干细胞向成骨分化。推测,核受体VDR协同龟板提取物在骨髓间充质干细胞向成骨分化过程中起到的重要的作用,其可能与BMP通路密切相关。
胡沙雅[8]2014年在《骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞与Wnt/β-catenin通路中β-catenin的关系》文中提出目的扩张型心肌病(dilated cardiomyoPathy,DCM)为死亡率较高的一种疾病,目前尚未报道其有效的治疗措施。近些年研究的干细胞治疗技术为它带来了新的曙光。本研究试图通过5-aza诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞,并了解在该过程中Wnt/β-catenin信号通路是否参与分化过程的调控,旨在为临床充分利用来源丰富的BMSCs(bone marrowmesenchymal cells,BMSCs)移植治疗终末期扩张型心肌病提供有效的实验依据。方法：从200g左右的SD雄性大鼠股骨提取BMSCs,,利用贴壁培养方法,培养至P3代细胞后利用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)来检测细胞的表面抗原：主要选取CD29、CD34、CD45、CD105等四种表面抗原进行检测,从而达到鉴定骨髓间充质干细胞的目的。台盼蓝染色计数细胞活性。选择活性较好,纯度较高的细胞制成细胞悬液,随机均匀分成a组、b组、c组、d组,分别用0μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L的5-aza进行干预,2周后比较总体细胞水平的活性率及心肌细胞的百分比,从而确定诱导分化的最佳浓度。此后将P3代骨髓间充质干细胞随机分成2组,即实验组及对照组。实验组为A组需加入最佳诱导浓度的5-aza培养24h诱导分化,经处理后更换为不含5-aza的培养基继续培养4周,根据培养时间的不同分成四组,即为培养第1周末、第2周末、第3周末、第4周末的各组细胞,分别对应为A1、A2、A3、A4四组。对照组B组不添加5-aza,参照A组的分组方法分别分为B1、B2、B3、B4四组；对各组细胞进行如下操作：①记录不同时期细胞的生长状态及形态；②行免疫荧光检测心肌细胞中的特异性cTnT来鉴定心肌细胞,计数心肌细胞百分比；③采用蛋白印迹法(western blot, WB)检测各组cTnT及β-catenin蛋白表达量,比较各组蛋白表达的变化。结果：应用FCM检测显示贴壁法培养获取的P3代BMSCs高表达CD29、CD105(分别为93.37%、89.08%)；而极少的表达CD34、CD45(分别为0.89%、1.06%)。经台盼兰试验测定其整体活细胞百分率>95%；通过对P3代BMSCs分别加入浓度为0μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L的5-aza进行干预的a组、b组、c组、d组,2周后细胞的活性率及心肌细胞的百分率分别如下：①总细胞活性率：a组为94.2±7.4(%),b组为93.6士7.1(%),c组93.5士6.7(%),d组80.1±9.2(%),将各组数据行方差分析得出,a组、b组、c组各组细胞间总细胞活性率无明显差异,但与d组比较,P<0.05,有统计学意义。②心肌细胞百分比：a组、b组两组未见心肌细胞,心肌细胞百分比为0,c组心肌细胞百分率为3.33±0.58(%),4.33±0.58(%),将c组、d组行配对t检验得出,P>0.05,无统计学意义。综合分析得出：c组即经10μmol/L的5-aza处理可将BMSCs诱导分化为心肌细胞,总细胞活性率较高。由BMSC分化而来的心肌细胞经标记特异性cTnT蛋白的免疫荧光染色后,在显微镜下表现为染红色荧光的细胞,各组心肌细胞百分比分别为：A1组及B组所有组别细胞显镜下未见心肌细胞形成,百分比为0(%)；A2心肌细胞百分率为3.33±1.53(%)；A3组心肌细胞百分比为19.67±1.53(%),A4组为25.67±2.1(%)。将所得数据行方差分析得出A2、A3、A4各组间P<0.05,有统计学差异。western blot技术检测cTnT的表达结果,A2组(1.231±0.017)、A3组为(6.606±0.227)、A4为(8.511±0.392)明显高于B1(0.824±0.012)、B2(0.826±0.138)、B3(0.827±0.02)、B4(0.827±0.004),A1(0.819±0.062),A组、B组行配对t检验后得出,A2与B2、A3与B3、A4与B4,P<0.05,有统计学意义,A1与B1,P>0.05,无明显差异。A1、A2、A3、A4各组行方差分析,P<0.05,各组间存在差异；B组行方差分析则未见差异。免疫荧光与western blot检测cTnT结果是相一致的。各组细胞β-catenin蛋白的表达结果为：B组各组细胞β-catenin蛋白的表达检测不出。A组各组表达如下：A1(1.877±0.044)、A2(7.634±0.329)、A3(1.084±0.092)、A4(0.473±0.025),经方差分析得出各组之间差异有统计学意义。结论：1.全骨髓贴壁法培养可获得足量、可靠的BMSCs,其表达的表面抗原符合BMSCs的特征。2.5-aza可成功诱导BMSCs分化为心肌细胞,且10μmol/l的5-aza浓度为本实验的最佳浓度。3.BMSCs分化形成的心肌细胞表达的cTnT蛋白随时间延长而逐渐增加,分化形成的心肌细胞数量也随之增多。4.β-catenin与cTnT表达的存在时间差异,推测在Wnt/β-catenin信号通路中,β-catenin可能参与调控BMSCs分化为心肌细胞。
王海萍[9]2007年在《骨髓间充质干细胞和P19细胞体外诱导向心肌分化及细胞移植修复梗死心肌的研究》文中研究说明急性心肌梗死是严重危害中老年人身体健康的常见病、多发病。目前临床缺乏针对患者梗死心肌的再造和再生的根本性治疗方法,虽然发病4-6小时内及时溶栓、介入治疗使梗死相关血管早期持续开通可挽救濒临死亡的心肌细胞,但绝大多数患者就诊时缺血心肌已有坏死,此时再灌注治疗只能防止梗死范围的扩大,而对于已坏死的心肌无效。由于成人心肌组织无分化再生能力,其坏死心肌细胞只能由成纤维细胞取代而形成无收缩功能的瘢痕组织,终致心衰,甚至猝死,严重影响患者生活质量和寿命。在这种情况下,有人提出可以通过再生心肌细胞,即心肌细胞成形术,来治疗缺血性心肌病导致的心肌梗死甚至心力衰竭,也就是通过移植外源性细胞到损伤的心肌中,用足量的具有收缩功能的细胞恢复和改善病变区域心肌的功能。目前在动物实验中有多种细胞被用来进行心肌细胞成形术,如胚胎心肌细胞、胚胎干细胞、成肌细胞(即骨骼肌卫星细胞)及骨髓间充质干细胞等被陆续用来做细胞移植治疗研究。来源于自身的骨髓间充质干细胞( marrow mesenchymal stem cells, MSCs)可在体外大量扩增,且具有多向分化潜能,能在适当的微环境中,分化为骨、软骨、脂肪、肝、神经、内皮、平滑肌、骨骼肌细胞和心肌样细胞。MSCs的应用由于没有医学伦理和免疫排斥等问题,目前是研究得较多的进行细胞移植以治疗缺血性心肌病的供体细胞。胚胎畸瘤细胞(embryonal carcinoma cells, EC)细胞与胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES)在分化潜能、超微结构、细胞表面抗原和生化特性等方面具有相似性,同时与ES细胞相比, EC细胞在无需饲养层和白细胞抑制因子(leukemia inhibitory factory, LIF)条件下培养即可保持未分化状态,更易于培养,且易于进行基因操作,而且通过分化培养过程EC细胞可从恶性表型转化为非恶性表型,因此EC细胞的研究应用日益受到广大研究者的青睐。P19EC细胞系是McBurney等从C3H/He小鼠畸胎瘤中分离得到的具有多向分化潜能的胚胎性干细胞,其在体外培养中单层生长无需饲养层即可迅速大量扩增,经多次传代仍保持胚胎干细胞特有标记,如表面糖蛋白SSEA-l及转录因子Oct-3等。在体外,通过条件培养P19细胞被诱导为包括心肌细胞、骨骼肌细胞、神经元等多种类型的细胞,且分化过程类似于胚胎细胞的早期分化。因此P19细胞常被作为研究细胞早期发育的体外模型系统。P19细胞向心肌细胞分化过程中,其发育相关基因的表达及电生理学特征基本模拟了正常小鼠心肌发育过程,被认为是研究心肌细胞发育的良好体外模型系统,其向心肌细胞的分化过程日益引起人们的关注。本课题拟通过应用不同方法、不同化学试剂体外诱导MSCs和P19细胞向心肌细胞分化,观察其分化过程中的形态学变化、心肌细胞早期转录因子及特异基因的表达,研究其生物学特性,摸索适宜骨髓间充质干细胞和P19细胞向心肌细胞分化的诱导方法,提高心肌细胞分化率,为建立高度标准化和最适宜的培养条件奠定基础;为大规模筛选心肌化干细胞的研究奠定基础;将胶体金标记的MSCs移植到SD大鼠冠脉结扎心梗模型的心肌组织中,观察移植细胞的生长分化情况和其在治疗心梗中的作用,探讨其作为进行细胞移植的供体细胞来治疗缺血性心肌病的可行性。本实验共分叁部分。1探讨了大鼠MSCs的体外分离、纯化、扩增和向心肌细胞的定向诱导分化条件利用贴壁培养的方法从成年SD大鼠股骨和胫骨骨髓中分离纯化MSCs。MSCs培养于由IMDM培养液,10%特等优质胎牛血清、1% L-谷氨酰胺和青霉素100 ug/ml、链霉素100μg/ml组成的完全培养基,首次于接种后24h换液,以后每3d换一次液。在相差显微镜下观察到:接种到培养瓶的原代细胞于接种后4小时开始贴壁,24小时后明显贴壁,3-5天后逐渐融合成片,细胞融合达80%-90%;原代培养的细胞较混杂,MSCs的形态大部分为梭形的成纤维细胞状,扁平状的细胞为其他基质细胞;随着换液次数的增加,悬浮的造血细胞逐渐减少,梭形的成纤维细胞状细胞逐渐增多。为了诱导MSCs向心肌分化,取材48小时后,将融合至70-80%的MSCs置入诱导培养基:10%优质胎牛血清、100 ug/ml青霉素、100μg/ml链霉素的IMDM中分别添加不同实验浓度的5-氮胞苷(5、10、15、μmol/L5aza)、二甲基亚砜(0.6%、0.8%、1.0% DMSO)、催产素(1×10-7、3×10-7、5×10-7μmol/L OT)、骨形态蛋白2(0.1、0.2、0.4ng/mL BMP-2)和碱性成纤维细胞生长因子(0.8、1.0、1.2ng/mL FGF-2)诱导剂。依次于24h、24 h、96 h、72 h、72 h后更换为完全培养基,阴性对照组采用完全培养基培养,每3天换一次液。为了鉴定各种诱导剂诱导分化的大鼠MSCs中是否含有心肌样细胞,进行了形态学观察和分子标志的检测。相差显微镜下观察到:在诱导后1-2w,少量成纤维细胞样的MSCs逐渐变长和变宽大,转变为具有肌管形成细胞形态特点的杆状或球状,椭圆形单核或多核细胞,到第3-4w部分细胞与周围细胞聚在一起。免疫细胞化学检测:诱导后的MSCs中均可见结蛋白(desmin),α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)、心肌特异性肌钙蛋白(cTnT)阳性细胞,5μmol/L 5aza、1.0% DMSO、1×10-7μmol/L OT、0.2 ng/mL BMP-2、1.0 ng/mL FGF-2组阳性细胞明显较其他组多,细胞分化率最高(P<0.01),desmin、α-sarcomeric actin阳性率较高,而c-TnT阳性率较低。激光共聚焦扫描显微镜观察:可见细胞质内desmin的表达呈红色,cTnT的表达呈绿色,当两者同时被观察时可见其重迭的部位变成黄色。同样细胞质内有α-sarcomeric actin表达的呈红色,有C-TnT表达的呈绿色,当两者同时被观察时可见其重迭的部位变成黄色。透射电镜观察:分化细胞的细胞核位于细胞中央,细胞质内可见到平行排列的肌丝,大量的粗面内质网和线粒体,富含糖原和核糖体。半定量RT-PCR结果显示:诱导7d后,MSCs弱表达GATA4,21d时表达增强,28d时表达减弱。诱导7d后,MSCs不表达α-MHC,21d弱表达,28d表达明显。各时间点BMP-2诱导组基因表达均明显强于其它各组(P<0.01)。2骨形态蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子对P19细胞向心肌细胞分化的影响将P19细胞接种于铺有0.5%软琼脂的培养皿中,分别用含0.2 ng/mL BMP-2和1.0 ng/mL FGF-2的分化培养基培养P19细胞, 24h后即可见多个悬浮的细胞团形成。细胞团呈球形,形状较规则,直径随时间延长不断增大,至第4天形成细胞聚集体/EBs。将细胞聚集体/EBs接种于预置有盖玻片的24孔培养板中,用不含BMP-2和FGF-2的培养基继续培养。倒置显微镜下观察可见EB样结构形状规则,位于EB中央的细胞密集、颜色较深,为EB的内核。EB开始贴壁生长后,中央细胞多层排列,增殖速度较快,细胞体积较小,具有高核质比,为未分化细胞;由EB边缘逐渐爬出细胞,在周边形成单层的生长晕。细胞生长晕中一些细胞变形,胞体伸长,体积增大,细胞呈放射状排列。免疫细胞化学鉴定:EB边缘生长晕中变形的细胞表达α-sarcomeric actin和cTnT。α-sarcomeric actin阳性率较高,而c-TnT阳性率较低。激光扫描共聚焦显微镜观察:在激光的激发下,各实验组EB边缘生长晕的部分细胞胞质中有α- sarcomeric actin表达的连接通道呈红色丝状免疫荧光标记,有cTnT表达的连接通道呈绿色丝状免疫荧光标记,当两者同时被观察时可见其重迭的部位变成黄色。透射电镜观察未经诱导的P19细胞胞核较大,细胞器丰富分布于细胞核周围,胞质中可见大量糖原颗粒。诱导后的细胞接近心肌细胞,具有心肌细胞发育早期的特征:单一卵圆细胞核;细胞器丰富,有较多的线粒体、内质网和高尔基体;胞浆中有较成熟的平行排列的成束肌丝,尚未形成肌节样结构。3观察大鼠MSCs同种异体移植后在梗死心肌中的存活、分化及对左室功能的影响采用结扎左冠状动脉前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型。按照对MSCs的处理方式和心肌内注射的成分不同随机分为3组:A组12只,大鼠心肌梗死后接受MSCs移植治疗;B组12只,大鼠心肌梗死后移植经5-aza体外诱导的MSCs;C组12只,列为对照组,大鼠心肌梗死后注射等量培养基。纳入分组的对象排除了建模和心肌内注射等任一环节失败的实验动物。分别于干细胞移植后2周、4周,常规取材,通过HE染色观察移植细胞的存活和分布,通过心肌特异性肌钙蛋白(cTnT)和α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)的免疫细胞化学染色观察细胞形态学变化。HE染色观察到移植细胞分布于心外膜下、梗死区及与正常心肌的交界处。免疫细胞化学染色结果显示:(1)在移植2周,移植部位有较少的α-sarcomeric actin阳性细胞,在移植后4周,阳性细胞数量较多。(2)移植后2周,仅见个别移植细胞cTnT阳性表达。移植后4周,在位于移植区与正常心肌交界处的部分移植细胞胞质中cTnT表达阳性。免疫细胞化学鉴定结果证明在移植2周,MSCs开始向成肌细胞方向分化,4周后MSCs向心肌细胞分化。4周后通过血流动力学各项指标评价MSCs移植对大鼠心功能的改善情况。结果:与对照组C组相比,移植组A, B两组LV功能显着改善(P<0.01)。A, B两组之间无显着性差异。移植组左心室收缩压(LVSP)、左心室等容期压力最大变化速率(±dp/dtmax)明显高于对照组(P<0.01),左心室舒张末期压(LVEDP)明显低于对照组(P<0.01)。结果提示:同种异体MSCs移植入大鼠心肌梗死区后能明显改善心肌梗死后大鼠的心功能。小结1大鼠MSCs在体外经5-aza、DMSO、OT、BMP-2、FGF-2诱导可定向分化为心肌样细胞。电镜及免疫细胞化学研究显示分化的心肌细胞具有早期心肌细胞的结构特征。2 5-aza、DMSO、OT、BMP-2、FGF-2诱导分化过程中MSCs内心肌细胞分化相关转录因子GATA4的表达随诱导时间变化提示它可能参与MSCs向心肌样细胞分化的转录调控。3 BMP-2、FGF-2暴露结合悬浮培养可有效的促使P19细胞聚集形成囊性EBs,并诱导P19细胞向心肌细胞分化。4同种异体MSCs可在梗死大鼠心脏存活、迁移分布,并能分化为心肌样细胞。5 MSCs在被移植到缺血心肌组织中后,周围的微环境可以诱导MSCs向功能肌细胞分化,导致移植后动物心功能明显增加。与未诱导的MSCs相比,5-aza诱导的MSCs移植并未表现出更多的优越性。
王跃嗣[10]2005年在《人nthESC向HSC诱导分化和胚胎造血标志物表达研究》文中进行了进一步梳理造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)是近年来研究较多的一类组织干细胞,目前发现卵黄囊、胎肝、主动脉-性腺-中肾区(AGM)、胎儿血液以及胎盘中均存在具有高度扩增能力的HSC。本论文主要进行了具有课题组专利的人自体基因胚胎干细胞(nthESC)向造血干细胞的诱导分化、人胚胎发育过程中卵黄囊、胎肝和胎盘中的造血发育以及胎盘贴壁细胞的分离培养、向神经细胞诱导分化的研究,为nthESC 和HSC的临床应用提供了理论依据和技术方法。1. 探讨了人胚骨髓间充质干细胞(MSC)的体外分离、扩增、冻存、复苏、转GFP基因和向成骨和神经细胞的诱导分化条件,结果发现MSC有60%可转染GFP基因,表达CD29、CD13、CD59,而CD34、CD45和CD38表达阴性。Vimentin染色阳性,mallory染色显示胶原存在,分离的细胞可在神经诱导体系和成骨诱导体系下进一步向神经细胞和成骨细胞分化。表明MSC在体外能迅速扩增,具有向成骨和神经细胞分化潜能,可以作为稳定饲养层来源。2. 利用人MSC 与人nthESC 共培养,研究人MSC 对胚胎干细胞诱导造血的作用并建立一种有效诱导nthESC 为HSC 的方法。经过20 d 培养,获得大量的CD133+和CD34+绿色荧光标记的HSC。来源于nthESC 的KDR+细胞首先出现在第5 天,CD133 随后出现,CD34+细胞出现在第7 天,随时间延长叁者表达增强,第11 天左右表达最强,随后减弱,20 d 仍有表达。培养中发现11 d 可形成小造血集落,14 d 形成大集落。在BMP4、FGF-1和VEGF 等因子作用下,可促进造血细胞形成。结果显示由nthES 与MSC 共培养可产生CD34+细胞,nthESC 的造血分化程序为先形成KDR+细胞,其次是CD133+,再形成CD34+细胞。表明nthESC 可在人胚骨髓MSC 饲养层上有效诱导成HSC。3. 采用分阶段悬浮培养法,首先诱导nthESC 形成拟胚体(EB),在此过程中添加BMP4 和FGF-1。第二阶段,打散EB,再添加VEGF 和其他细胞因子,对HSC 进行扩增。结果发现,采用低黏附板可有效促进EB 形成,BMP4 和FGF-1 可使EB 形成数量明显增加,可使KDR+和CD133+荧光细胞数量明显增多。添加VEGF 等细胞因子,可有效促进CD34+细胞数量增加。结果表明,联合使用BMP4、FGF-1、VEGF 和SCF 等细胞因子,可使悬浮培养形成EB 数量增加,产生更多的造血前体细胞,继而产生大量HSC。
参考文献：
[1]. 大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及BMP2在诱导其向神经元样细胞分化中的作用[D]. 李勇. 第叁军医大学. 2004
[2]. 胰岛素样生长因子诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化[D]. 许永涛. 华中科技大学. 2009
[3]. 冲击波诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的机制[D]. 张科强. 吉林大学. 2008
[4]. 神经嵴来源外胚间充质干细胞在牙向分化中的潜能及相关机制的研究[D]. 行勇军. 第叁军医大学. 2016
[5]. 山羊骨髓间充质干细胞体外分离与培养[D]. 华松. 西北农林科技大学. 2004
[6]. 转染mIFNγ的骨髓间充质干细胞治疗大鼠胶质瘤的实验研究[D]. 刘颖. 吉林大学. 2006
[7]. 维生素D受体介导龟板诱导的骨髓间充质干细胞向成骨分化[D]. 侯秋科. 广州中医药大学. 2010
[8]. 骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞与Wnt/β-catenin通路中β-catenin的关系[D]. 胡沙雅. 湖南师范大学. 2014
[9]. 骨髓间充质干细胞和P19细胞体外诱导向心肌分化及细胞移植修复梗死心肌的研究[D]. 王海萍. 河北医科大学. 2007
[10]. 人nthESC向HSC诱导分化和胚胎造血标志物表达研究[D]. 王跃嗣. 西北农林科技大学. 2005