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黄瓜CsMPC1和CsE1α基因在线粒体介导植物PCD中的作用研究

2020-12-08阅读(136)

黄瓜CsMPC1和CsE1α基因在线粒体介导植物PCD中的作用研究

论文摘要

水杨酸（SA）是植物防御的关键信号因子,可以诱导某些抗病基因的表达,在植物抗病中起重要作用。课题组前期研究证实,SA能够诱导黄瓜叶片发生超敏反应（HR）,是一个细胞程序性死亡（PCD）的过程。为进一步探究SA的作用机制,对SA处理前后的黄瓜叶片进行了转录组分析,得到1756个差异表达基因。本研究选择与线粒体功能相关的显著上调表达的CsMPC1和CsE1α基因,研究其表达特性,利用超表达拟南芥和突变体拟南芥研究基因的功能,为揭示基因在线粒体介导的PCD中的作用奠定基础。研究结果如下:1.用10mM SA和0.2%MeJA分别处理黄瓜叶片,在营养器官根、茎、叶和MeJA处理叶片进行CsMPC1和CsE1α基因的qRT-PCR表达分析,并对根、茎、叶和SA和MeJA处理叶片进行相应指标丙酮酸（PA）含量和丙酮酸脱氢酶（PDH）活性测定。CsMPC1和CsE1α基因在叶片中具有较高表达量,在MeJA处理介导PCD过程皆呈上调表达调控;CsMPC1丙酮酸转运体基因水平改变引起其转运PA含量的变化,比较发现两者呈负相关;CsE1α丙酮酸脱氢酶基因水平的改变影响PDH活性的变化,比较发现两者呈正相关。但MeJA和SA处理发生PCD过程中PDH活性无明显变化。2.根据mRNA开放读码区序列设计引物,从黄瓜中克隆CsMPC1和CsE1α基因。CsMPC1基因cDNA全长311bp,蛋白由103个氨基酸构成。CsE1α基因cDNA全长1199bp,蛋白由399个氨基酸构成。通过NCBI BlastX比对测序结果显示CsMPC1属于MPC超家族,CsE1α属于TPP超家族。3.构建CsMPC1和CsE1α基因的超表达载体,通过农杆菌介导的浸花法将质粒转入到野生型拟南芥植株中,获得了转CsMPC1和CsE1α基因拟南芥植株。利用三引物法将从拟南芥生物资源中心获得MPC1基因（SALK089763.42.10.x）和E1α基因（SALK056967.56.00.x）T-DNA插入突变体进行PCR鉴定获得纯合株系。4.对筛选出的MPC1和E1α的超表达拟南芥植株（OE-1和OE#-1）和突变体拟南芥植株（mpc1-1和E1α-1）进行表型鉴定、生理指标测定和PCD鉴定。结果如下:（1）突变体植株mpc1-1对ABA敏感,具有抗旱的功能;超表达植株OE-1转运PA水平升高,表明PA转运体行使功能;突变体植株mpc1-1转运PA水平降低,表明PA转运受到阻碍,导致线粒体功能下降,糖酵解途径增强,植株生长受到抑制,但在超表达和突变体植株中均未检测到PCD现象。说明MPC1基因超表达与敲除时,PA代谢发生变化但并不影响植物PCD的发生,这是因为在MPC1基因敲除时MPC家族其他转运蛋白仍在行驶功能,MPC1基因超表达时植株正常生长没有出现细胞死亡现象。（2）超表达植株OE#-1正常生长,并且PDH活性与WT无明显差异,没有出现细胞死亡的现象;在突变体植株E1α-1中PDH活性受到抑制,生物体的有氧代谢受到阻碍,严重阻碍细胞的呼吸,导致ROS大量积累,可能引起植物PCD发生,从而影响植株正常生长发育。这说明E1α基因敲除可能引起植物PCD的发生。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 绪论
  •   1.1 植物PCD的研究进展
  •     1.1.1 植物PCD的发生机制
  •     1.1.2 植物PCD中线粒体介导作用的研究进展
  •   1.2 水杨酸和茉莉酸的研究进展
  •     1.2.1 水杨酸和茉莉酸的研究现状
  •     1.2.2 水杨酸和茉莉酸在植物防御中的信号传递
  •     1.2.3 水杨酸和茉莉酸与PCD的关系
  •   1.3 植物PCD中线粒体相关基因的研究进展
  •     1.3.1 线粒体丙酮酸转运体研究进展
  •     1.3.2 线粒体丙酮酸脱氢酶研究进展
  •   1.4 本研究的目的意义、研究内容与技术路线
  •     1.4.1 本研究的目的与意义
  •     1.4.2 研究内容
  •     1.4.3 技术路线
  • 第2章 黄瓜CsMPC1和CsE1α基因的表达分析
  •   2.1 植物材料的培养
  •     2.1.1 植物材料的培养和前期处理
  •     2.1.2 引物
  •     2.1.3 化学试剂和试剂盒
  •     2.1.4 仪器
  •     2.1.5 营养液的配制
  •   2.2 试验方法
  •     2.2.1 黄瓜叶片的总RNA提取
  •     2.2.2 cDNA的合成
  •     2.2.3 黄瓜线粒体相关基因CsMPC1和CsE1α的表达检测
  •     2.2.4 黄瓜丙酮酸（pyruvic acid,PA）含量和丙酮酸脱氢酶（Pyruvatedehydrogenase,PDH）活性测定
  •     2.2.5 统计分析
  •   2.3 结果与分析
  •     2.3.1 水杨酸、茉莉酸甲酯处理黄瓜叶片的形态变化
  •     2.3.2 黄瓜总RNA的提取结果
  •     2.3.3 CsMPC1和CsE1α基因的RT-PCR表达分析
  •     2.3.4 CsMPC1和CsE1α基因的qRT-PCR表达分析
  •     2.3.5 丙酮酸（pyruvic acid,PA）含量和丙酮酸脱氢酶（pyruvatedehydrogenase,PDH）活性的测定
  •   2.4 讨论
  •     2.4.1 CsMPC1和CsE1α基因受SA和MeJA诱导的表达分析
  •     2.4.2 CsMPC1和CsE1α基因的表达水平与相关生理指标的关系
  • 第3章 黄瓜CsMPC1和CsE1α的编码区全长序列的克隆及生物信息学分析
  •   3.1 试验材料
  •     3.1.1 植物材料的培养
  •     3.1.2 菌株
  •     3.1.3 化学试剂和试剂盒
  •     3.1.4 主要仪器
  •   3.2 试验方法
  •     3.2.1 黄瓜总RNA的提取
  •     3.2.2 基因扩增
  •     3.2.3 CsMPC1和CsE1α基因cDNA序列克隆
  •     3.2.4 克隆产物序列测定及分析
  •   3.3 结果与分析
  •     3.3.1 黄瓜CsMPC1和CsE1α基因克隆及质粒双酶切鉴定
  •     3.3.2 黄瓜CsMPC1和CsE1α基因测序及序列分析
  •   3.4 讨论
  • 第4章 黄瓜CsMPC1和CsE1α基因表达载体的构建及转化拟南芥
  •   4.1 试验材料
  •     4.1.1 植物材料的培养
  •     4.1.2 载体与菌株
  •     4.1.3 化学试剂和试剂盒
  •   4.2 试验方法
  •     4.2.1 表达载体构建
  •     4.2.2 重组质粒导入农杆菌
  •     4.2.3 浸花法转化拟南芥
  •     4.2.4 转化拟南芥株系的筛选
  •     4.2.5 转基因拟南芥的PCR鉴定
  •     4.2.6 转基因拟南芥的qRT-PCR检测
  •   4.3 结果与分析
  •     4.3.1 黄瓜CsMPC1和CsE1α表达载体的构建及双酶切验证
  •     4.3.2 黄瓜pBI121-CsMPC1/CsE1α农杆菌转化及验证
  •     4.3.3 转基因拟南芥的PCR鉴定
  •     4.3.4 转基因拟南芥的qRT-PCR检测
  •   4.4 讨论
  • 第5章 MPC1和E1α的超表达和突变体拟南芥生理指标测定和PCD鉴定
  •   5.1 试验材料
  •     5.1.1 植物材料的培养
  •     5.1.2 化学试剂和试剂盒
  •     5.1.3 主要仪器
  •   5.2 试验方法
  •     5.2.1 纯合突变体植株的筛选
  •     5.2.2 MPC1和E1α的超表达和突变体拟南芥植株形态观察和表型鉴定
  •     5.2.3 mpc1-1突变体拟南芥对干旱胁迫响应分析
  •     5.2.4 MPC1和E1α的超表达拟南芥和突变体拟南芥植株相关生理指标鉴定
  •     5.2.5 MPC1和E1α的超表达和突变体拟南芥PCD鉴定
  •     5.2.6 统计分析
  •   5.3 结果与分析
  •     5.3.1 MPC1和E1α的突变体拟南芥纯合株系鉴定
  •     5.3.2 MPC1和E1α的超表达和突变体拟南芥植株形态分析
  •     5.3.3 MPC1和E1α的超表达和突变体拟南芥植株表型鉴定
  •     5.3.4 mpc1-1突变体拟南芥对干旱胁迫响应分析结果
  •     5.3.5 MPC1和E1α的超表达和突变体拟南芥植株相关生理指标鉴定
  •     5.3.6 MPC1和E1α的超表达和突变体拟南芥PCD鉴定结果
  •   5.4 讨论
  •     5.4.1 MPC1基因与PCD的关系
  •     5.4.2 E1α基因与PCD的关系
  •   5.5 本研究的创新点和下一步工作
  • 结论
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间所发表的学术论文
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 王丹丹

    导师: 丁国华

    关键词: 水杨酸,线粒体,基因表达,克隆

    来源: 哈尔滨师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,园艺

    单位: 哈尔滨师范大学

    分类号: Q943.2;S642.2

    总页数: 73

    文件大小: 6069K

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