何飞燕[1]2004年在《野油菜黄单胞菌8004与胞外多糖合成相关基因的鉴定》文中进行了进一步梳理野油菜黄单胞菌野菜致病变种(Xanthomonas campestris pv．campestris，以下简称Xcc)是一种能在全球范围内引起十字花科植物黑腐病的病原性细菌。胞外多糖是Xcc的重要致病因子之一，也是一种重要的工业多糖。本实验室已构建了Xcc 8004的Tn5gusA5插入突变库，并对16462株突变体的EPS产量进行了平板检测，获得了75株胞外多糖产量下降突变株。本工作用2％葡萄糖的NYGA平板上检测，对这75个突变体进行了重新筛选，得到了51株胞外多糖缺陷的突变体，它们分布在45个ORF中。其中11个ORF前人已证实与胞外多糖合成有关：34个ORF未报道与胞外多糖的产生相关，这34个ORF中13个编码的为假设保守蛋白。本工作选择这13个编码的为假设保守蛋白的基因的一个，编号为XC0877，进行进一步研究，以确定该ORF是否与EPS合成有相关。根据Xcc 8004的Tn5gusA5插入突变库的资料，XC0877 ORF中有四个独立的Tn5gusA5插入突变体，其中有两个突变体为胞外多糖缺陷型，另两个突变体为胞外多糖产生正常。我们初步认为这种表型不一致的原因有可能是ORF界定有误。为了确证XC0877 ORF与胞外多糖产生的关系，我们采用同源单交换的方法构建了该ORF的非极性定点整合突变体。并对所得突变体进行了胞外多糖产量检测，出乎意料的是在这些突变体中大约有一半表现为缺陷型而另一半则表现为胞外多糖产生正常。用PCR方法扩增野生型XC0877 ORF(包括启动子)，并克隆到pLAFR3上，进行反式互补，结果未能恢复突变体的胞外多糖的产量。综合以上结果，XC0877 ORF是否与胞外多糖产生有关还需进一步研究。
马增凤[2]2006年在《野油菜黄单胞菌的一簇与胞外多糖及致病性有关的基因的鉴定和分析》文中指出本研究通过摇瓶发酵试验，从已构建的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)8004的Tn5gusA5插入突变体库中筛选到胞外多糖降低显着的XC3813的突变体133A11。为了研究该基因与胞外多糖的关系，利用自杀质粒pK18mob，对XC3813以及其邻近基因XC3814、XC3815进行诱变，获得了XC3813、XC3814、XC3815的非极性突变体NK3813、NK3814、NK3815。平板检测和摇瓶发酵试验表明，NK3813、NK3814、NK3815的菌落形态大小与野生型8004相比小，而且干；胞外多糖的产量分别为野生型8004的41.3％、49.6％、32.0％。同时NK3813、NK3814、NK3815在NYGB和MMX培养基上的生长排除这叁个突变体在生长和营养方面有缺陷的可能，说明这叁个基因与胞外多糖的生物合成相关。用剪叶接种法以OD_(600)=0.001的菌液浓度接种寄主满身红萝卜(Raphanus sativus L. var. radiculus Pers. )，发现接种10天后NK3813、NK3814、NK3815引起的平均病斑长度与野生型8004相比分别降低到19.0％、0％、28.9％。表明这叁个基因与致病相关。采用PCR分别扩增XC3813、XC3814、XC3815的全基因片段，所得的产物克隆至pLAFR3和pLAFR6，得到的重组质粒导入相应的突变体中，都能够使突变体胞外多糖的产量完全恢复到野生型的状态，致病力分别恢复到野生型8004的89.9％、97.5％、91.1％。这些结果表明XC3813、XC3814、XC3815与胞外多糖的生物合成相关，与致病性相关。
李群良[3]2002年在《野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个与胞外多糖产生相关的基因的鉴定》文中提出野油菜黄单胞菌野菜致病变种(Xcc)是一种能在世界范围内引起十字花科植物致病的革兰氏阴性细菌，其显着特征是能产生胞外多糖(EPS)。胞外多糖一直被认为是Xcc的致病因子之一，同时，由于其特殊的理化性质而被广泛应用于工业生产，因而对胞外多糖生物合成机理的研究在不断深入。本研究中，我们利用转座子Tn5gusA5随机插入诱变Xcc野生型菌株8004，构建了含17，280株突变体的Xcc突变体库。通过热不对称嵌套式PCR(TALL—PCR)和测序确定了转座子Tn5gusA5插入在Xcc基因组中的位置。通过平板检测的方法，在含2％葡萄糖的NYGA平板上从突变体库中筛选到17株胞外多糖缺陷突变体。根据其菌落形态特征，将这些突变体分为3类。致病性检测结果表明，13株突变体丧失了致病力，3株突变体致病力明显降低，而另外2株突变体仍具有与野生型8004相同的致病力。在这17株胞外多糖缺陷突变体中，14株突变体中被突变的ORF的注释功能与胞外多糖的产生相关，而另外3株被突变的ORF与胞外多糖的产生的关系尚不清楚。为了验证这3个ORF与胞外多糖的产生有关，我们成功地构建了这3个ORF的缺失突变体。结果表明Xcc_114缺失突变株的表型与相应ORF的Tn5插入突变株的表型一致，表现为胞外多糖缺陷，而另外两个缺失突变株与野生型8004一致，未表现出胞外多糖缺陷。Xcc_114长756bp，通过NCBI中的blast搜索，结果表明其编码产物与一种跨膜蛋白具有较高的同源性，推测可能与多糖的胞外运输有关。
李祥江[4]2005年在《野油菜黄单胞菌锌吸收调控蛋白的鉴定》文中进行了进一步梳理锌吸收调控蛋白(Zinc uptake regulator, Zur)是一个金属调控蛋白,在许多细菌中负调控高亲和性的锌吸收系统。当细胞内锌离子浓度过高时,Zur被激活并阻碍高亲和性锌吸收系统对锌的吸收,避免过量的锌对细菌产生毒性。在Xcc8004基因组中没有注释zur基因,用大肠杆菌的Zur蛋白序列比对Xcc8004基因组,发现编号为XC1430的ORF(原来注释为Fur family transcriptional regulator)编码的蛋白与大肠杆菌的Zur蛋白有42%的相似性。通过整合突变的方法构建了XC1430的突变体NK1430。NK1430在含400μM Zn~(2+)的丰富培养基和含110μM Zn~(2+)的基本培养基不能生长,而野生型8004和互补菌CNK1430则能正常生长。在含300μM Zn~(2+)的丰富培养基中,NK1430菌体积累的锌为4.21μg/10~(10)个细胞,而8004和CNK1430分别只有1.67和1.83μg/10~(10)个细胞。这表明XC1430编码的产物是锌吸收调控蛋白。为了确定XC1430与Xcc致病的关系,对NK1430进行了致病性实验。用剪叶接种法以OD_(600)=0.1的菌液浓度接种寄主满身红萝卜(Raphanus sativus L. var. radiculus Pers.),结果发现接种10天后Zur突变体NK1430引起的平均病斑长度为3.1mm,而8004和CNK1430的引起平均病斑长度分别为13.3mm和13.2mm,表明Zur是Xcc致病所必需的。HR反应检测结果显示NK1430在辣椒叶上引
彭方印[5]2007年在《野油菜黄单胞菌叁个与致病性及EPS相关基因的调控基因的鉴定》文中研究表明野油菜黄单胞菌中XC3813、XC3814、XC3815是叁个与致病性及胞外多糖相关的基因，分别被注释为保守假定蛋白、脂多糖核心合成糖基转移酶、保守假定蛋白。为了进一步研究这叁个基因的功能，本研究扩增含不同长度启动子区的互补片段，对非极性整合突变体NK3813、NK3814、NK3815进行反式互补，初步确定了这叁个基因启动子的关键区域。在此基础上，构建了GUS报告系统，定量研究了调控基因rpfC、opsX、clp对这叁个基因表达的影响，并检测了这叁个基因在寄主植物体内的表达水平。为寻找XC3813、XC3814上游潜在的正向调控基因，将该基因的启动子区与蔗糖敏感报告基因SacB相连接，构建报告质粒Pro3813SacB、Pro3814SacB。将此报告质粒导入Xcc 8004，并利用转座子诱变系统EZ-Tn5
姚子颖[6]2005年在《野油菜黄单胞菌8004菌株wxc基因簇的功能分析》文中进行了进一步梳理野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是一种能在全球范围内引起所有十字花科植物黑腐病的重要病原细菌。脂多糖是该菌与致病相关的生化因子之一,在Xcc B100菌株中wxc基因簇参与了LPS的O-抗原和核心多糖的合成。全基因组测序分析表明Xcc 8004有着与Xcc B100不同的WXC基因簇。为明确在Xcc 8004中该基因簇的功能,构建了其中wxcN、rmd、wzt和XC3621等4个基因的整合突变体PK3620、NK3626、NK3632和NK3621,并检测了这些突变体的致病力、LPS和EPS等表型特征。SDS-PAGE分析显示NK3626的带型与8004差异显着,推测基因rmd可能参与LPS核心多糖的合成。致病性试验发现PK3620和NK3626致病力均降低到8004的50%以下,经过反式互补其致病力又回复到野生型的71.7%和90.3%;EPS摇瓶发酵试验也显示PK3620、NK3626和NK3632的EPS产量显着降低,反式互补后其EPS产量分别回复和超过了野生型菌株的水平。由此证实在Xcc8004菌株的wxc基因簇中,基因wxcN和rmd同时与致病性和EPS合成密切相关,而基因wzt仅与EPS合成相关。另外本研究显示突变体NK3621的多种表型特征与8004野生型菌株相比并无明显变化,因此基因XC3621的确切功能尚待进一步研究。
韩仲吉[7]2006年在《野油菜黄单胞菌双组分信号系统基因的敲除及一个多糖合成相关基因的分析》文中认为野油菜黄单胞菌野油菜致病型(Xanthomonas campestris pv. campestris Xcc)是一种化能异养、单鞭毛,能产生胞外多糖的革兰氏阴性细菌。该细菌可在世界范围内引起十字花科植物的黑腐病(black rot disease),造成重大经济损失。目前,对其防治还缺乏有效的方法。因此,了解该细菌致病过程当中的信号转导过程将有利于发展新型的抗病或防病策略与手段。在原核生物中,双组分信号传导系统(two-component signal transduction system)是调控生理代谢的主要调控系统,对病原菌的致病性也有重要作用。该系统由组氨酸激酶和效应调节蛋白两部分组成。为了系统地研究Xcc的双组分信号系统,我们利用基于同源重组的单交换方法来构建双组分信号系统基因的突变体,从遗传学角度对其进行深入研究。通过生物信息学方法,根据双组分信号系统效应调节蛋白(response regulator,RR)的保守序列(D1, D2和K-boxes)预测出了Xcc ATCC 33913的全部RR基因。本研究从中挑选rr01-rr10共10个基因,根据基因内部序列设计引物,PCR扩增基因片断。回收的基因片断与不能在Xcc中复制的pKnockout-?或pK18mob自杀质粒载体相连,重组质粒经测序验证后电转化Xcc ATCC 33913。质粒上的基因片断与细菌染色体上的相应基因发生一次同源交换,产生被质粒序列打断的两个不完整基因拷贝,从而获得基因插入突变体。每个基因随机挑选6个克隆通过Southern blotting实验验证,结果表明以上10个基因都不是细菌的必须基因,均可被本研究所采用的突变方法失活。这些突变体被用于植物抗病、渗透性、温敏性等表型筛选实验,为从生物化学和生理学角度分析这些信号转导基因的功能提供遗传学研究基础。在以前的Xcc致病比较与功能基因组学研究工作中,通过EZ::TN
蒋瑞萍[8]2005年在《野油菜黄单胞菌野油菜致病变种panD基因的功能研究》文中进行了进一步梳理泛酸是乙酰辅酶A基本前体,乙酰辅酶A在生物大分子分解代谢和叁羧酸循环过程起着重要作用。在大肠杆菌中,用于泛酸生物合成的的β-丙氨酸主要是由L-天冬氨酸 α位脱羧而产生,这个生化反应由panD基因编码的L-天冬氨酸-α-脱羧酶催化。大肠杆菌panD基因突变体为β-丙氨酸营养缺陷型。在Xcc 8004基因组中存在一个与大肠杆菌panD基因高度同源的基因(ORF编号为XC2380,其编码的蛋白与大肠杆菌的PanD蛋白氨基酸序列有70.6%的相似性)。同时,在本实验室构建的Xcc 8004 Tn5gusA5插入突变体库中,得到了一个插入位点在panD基因的突变体121C07,通过与其转录下游基因突变体表型对比确定121C07对其下游基因没有极性效应。对121C07进行了一系列的表型检测,发现121C07和野生型Xcc 8004一样都能在基本培养基(MMX,不含β-丙氨酸)上生长,这说明121C07不是β-丙氨酸营养缺陷型。这一结果表明,Xcc 8004中泛酸合成途径与大肠杆菌存在一定的差异。用剪叶法,以OD_(600)同为0.001浓度接种寄主植物中华萝卜(Raphanus sativus L.var.radiculus Pers.),发现突变体的致病力有所下降(接种10天后平均病斑长度为:野生型Xcc 8004 12.29毫米,panD突变体121C07为4.56毫米)。对121C07进行EPS产量分析,121C07
危广宁[9]2004年在《野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个脂多糖合成相关基因的功能鉴定》文中研究指明本研究通过致病性试验，从已构建的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv．campestris，Xcc)8004的Tn5gusA5插入突变体库中筛选到一株致病力显着降低的突变体008G04。TAIL-PCR和测序分析表明，该突变体的Tn5gusA5插在与脂多糖合成相关的基因wxcB内。为研究wxcB基因与Xcc致病性的关系，利用自杀质粒pK18mob作为同源单交换整合质粒，获得了该基因的非极性突变体3512nk。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，3512nk脂多糖O-抗原发生明显变化。胞外多糖产量为野生型8004的45.3％，相对致病力为野生型的10.7％。将PCR合成的wxcB全基因克隆至pLAFR3，导入突变体中能够使突变体的O-抗原合成恢复正常，相对致病力恢复为野生型的64.6％。有趣的是，互补菌株的胞外多糖产量比野生型提高了4倍。该研究表明，wxcB基因参与了脂多糖O-抗原、胞外多糖的生物合成，且与Xcc的致病性相关。
谭旖宁[10]2006年在《野油菜黄单胞菌ED途径相关基因研究》文中研究表明对野油菜黄单胞菌8004菌株全基因组序列进行搜索发现，该菌株拥有完整的ED、EMP、HMP等糖代谢途径。根据基因组注释，Xcc 8004基因组中编号为XC1973-XC1977的ORF分别是编码ED途径相关酶的eda，edd，pgl，glk，zwf基因。从本实验室构建的Xcc 8004 Tn5gusA5插入突变体库中，获得一株zwf基因的突变体167D10，该突变体EPS合成产量减少。为研究ED途径相关基因的功能，本工作采用自杀质粒pK18mob诱变XC1973-XC1977，获得这5个基因的非极性突变体NK1973-NK1977。对NK1973(eda~-)、NK1974(edd~-)、NK1976(glk~-)、NK1977(zwf)的相关酶活性进行检测，NK1973、NK1974的2-酮-3-脱氧6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶及6-磷酸葡萄糖酸脱水酶组合酶活性分别比野生型8004菌株下降86％、92％，NK1976的葡萄糖激酶活性比野生型8004菌株下降95％，NK1977的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性比野生型8004菌株下降89％。采用不同碳源分析突变体的EPS产量，发现在以葡萄糖为主要碳源时，NK1973、NK1974、NK1976、NK1977的胞外多糖产量分别为2.155 g／L、4.280 g／L、1.100 g／L、4.260 g／L，比野生型8004菌株的9.657 g／L大幅度下降。用丙酮酸加葡萄糖、丙酮酸、果糖做主要碳源对NK1973-NK1977的胞外多糖产量进行检测，在前一种碳源中，NK1973-NK1977胞外多糖产量都比野生型8004菌株的大幅下降；在丙酮酸为碳源时，所有的突变体包括野生型8004菌株的胞外多糖产量都较少；在后一种碳源中，NK1976的胞外多糖产量高于野生型8004菌株，其它突变体的胞外多糖产量与野生型8004菌株比较结果与以葡萄糖为碳源时的结果相同。采用PCR分别扩增完整的XC1973、XC1974、XC1976和XC1977，获得的DNA片段连接在pLALR3上，分别互补NK1973、NK1974、NK1976和NK1977，能部分恢复胞外多糖产量。研究结果表明，Xcc 8004 ED途径影响胞外多糖合成产量。但在胞外多糖合成过程中的作用方式等问题都是未知的，有待进一步的研究。
参考文献：
[1]. 野油菜黄单胞菌8004与胞外多糖合成相关基因的鉴定[D]. 何飞燕. 广西大学. 2004
[2]. 野油菜黄单胞菌的一簇与胞外多糖及致病性有关的基因的鉴定和分析[D]. 马增凤. 广西大学. 2006
[3]. 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个与胞外多糖产生相关的基因的鉴定[D]. 李群良. 广西大学. 2002
[4]. 野油菜黄单胞菌锌吸收调控蛋白的鉴定[D]. 李祥江. 广西大学. 2005
[5]. 野油菜黄单胞菌叁个与致病性及EPS相关基因的调控基因的鉴定[D]. 彭方印. 广西大学. 2007
[6]. 野油菜黄单胞菌8004菌株wxc基因簇的功能分析[D]. 姚子颖. 广西大学. 2005
[7]. 野油菜黄单胞菌双组分信号系统基因的敲除及一个多糖合成相关基因的分析[D]. 韩仲吉. 华南热带农业大学. 2006
[8]. 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种panD基因的功能研究[D]. 蒋瑞萍. 广西大学. 2005
[9]. 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个脂多糖合成相关基因的功能鉴定[D]. 危广宁. 广西大学. 2004
[10]. 野油菜黄单胞菌ED途径相关基因研究[D]. 谭旖宁. 广西大学. 2006