猪流行性腹泻病毒引起Vero细胞凋亡的分子机制研究

论文摘要

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由冠状病毒科,α冠状病毒属成员的猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的以严重腹泻,伴有呕吐,脱水,食欲下降等特征的一种高度接触性烈性肠道传染病,主要危害仔猪,对于仔猪有极高的致病率以及致死率,严重危害养猪业的健康发展。自1971年首次在英国发现以来,该病已经陆续蔓延并传播至全球多个国家和地区,给养猪业带来了沉重的经济负担。目前对于该病预防控制主要依靠疫苗免疫,在治疗方法上却尚未有重大突破。而关于PEDV的致病机制尤其是在凋亡信号通路领域的研究还不完全清楚,需要进一步研究。因此,研究PEDV致Vero凋亡的分子机制对寻找新的抗病毒途径来说非常重要。本研究对PEDV感染Vero细胞的凋亡信号进行筛选并对凋亡信号与凋亡之间相关性进行研究,获得以下结果:1.用间接免疫荧光试验,Western blot以及流式细胞术筛选不同分子信号在PEDV感染Vero细胞中的变化情况。首先,用PEDV感染Vero观察细胞的病变效应,用间接免疫荧光试验观察PEDV的增殖,在证实PEDV感染能够导致细胞病变的基础上,用流式细胞术检测不同感染复数（MOI分别为0.1、0.5、1）的PEDV感染细胞24 h的细胞凋亡发生率,检测了p53家族、ROS含量以及MAPK家族蛋白在不同感染时间下的含量变化。结果显示,随着感染复数的递增,PEDV诱导Vero细胞的凋亡发生率也呈递增趋势。p53的Western blot试验表明PEDV能够显著活化p-p53（Ser20）,显著增加CBP（cAMP-responsive element-binding protein）和MDM2（Murine double minute2 protein）的表达,对p53的间接免疫荧光试验结果表明,在病毒感染期间,p53移位至细胞核发挥作用。MAPK家族的Western blot结果表明,PEDV感染能够显著活化p38 MAPK和SAPK/JNK,使p-p38 MAPK以及p-SAPK/JNK蛋白表达量增加。流式细胞术对不同PEDV感染时间的ROS含量检测结果说明,PEDV能够显著引发ROS的累积,且这种累积效应随感染时间延长而越加明显。2.用Western blot以及流式细胞术证实活化的ROS,MAPK以及p53家族与PEDV诱导Vero细胞凋亡之间的联系,采用抑制试验对本部分的结果加以验证。首先,用p53特异性抑制剂Pifithrin-α（PFT-α）预处理Vero细胞1 h后感染PEDV 24 h,后采用流式细胞术、Western blot检测凋亡率以及Bax、Bcl-2、FasL等凋亡相关蛋白的表达;其次,用p38 MAPK、JNK抑制剂SB203580以及SP600125预处理Vero细胞1 h后感染PEDV 24 h,检测Bax、Bcl-2、FasL等凋亡相关蛋白的表达;最后,用抗氧化剂NAC以及PDTC处理Vero细胞1 h后感染PEDV 24 h,流式细胞术、Western blot检测凋亡发生率以及Fas,FasL,Bax和Bcl-2等凋亡蛋白的相对表达量。结果表明,PEDV感染显著增加Bax的相对表达量,减少Bcl-2的相对表达量,且PFT-α作用下能够显著逆转由PEDV引起的Bax增多以及Bcl-2的降低,并上调Bax/Bcl-2比率,逆转PEDV引起的凋亡发生率,表明抑制p53能够显著逆转PEDV诱导的Vero细胞凋亡;与PEDV感染组相比,无论是SB203580还是SP600125处理组均无法改变Bcl-2、Bax和FasL的表达量,表明在抑制p38 MAPK和SAPK/JNK的情况下,无法逆转由PEDV引起的Vero细胞凋亡,即p38 MAPK和SAPK/JNK的活化与PEDV诱导的Vero细胞凋亡无关;与PEDV感染组相比,NAC、PDTC处理组的凋亡发生率也显著降低,FasL/Fas的比例在PEDV感染组或是抗氧化剂处理中没有显着变化,而Bax/Bcl-2的比率显着降低,表明PDTC和NAC处理明显逆转了PEDV诱导的细胞凋亡。进一步的抑制试验表明,p53部分由ROS介导,即ROS为p53上游。综上所述,PEDV感染引起Vero产生细胞病变并以剂量依赖的方式诱导Vero细胞发生凋亡,且PEDV感染能够诱导p53,p38 MAPK和SAPK/JNK的活化以及ROS的累积,活化的p53以及ROS参与PEDV诱导的Vero细胞凋亡,而p38 MAPK和SAPK/JNK的活化与PEDV诱导的Vero细胞凋亡无关。

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摘要

ABSTRACT

主要符号对照表

第一章文献综述

1.1 猪流行性腹泻病毒研究概述

1.1.1 PEDV的分类以及理化性质

1.1.2 PEDV的基因组结构及编码蛋白

1.1.3 PEDV的感染与致病机理

1.2 细胞凋亡的研究进展

1.2.1 细胞凋亡概述

1.2.2 细胞凋亡的过程

1.2.3 细胞凋亡的生理意义

1.2.4 细胞凋亡涉及的信号通路

1.2.5 病毒感染与细胞凋亡

1.3 本研究的目的与意义

第二章 PEDV诱导Vero细胞凋亡的分子信号筛选

2.1 材料

2.1.1 细胞、病毒与抗体

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器设备

2.1.4 相关试剂的配制

2.2 方法

2.2.1 Vero细胞培养,复苏,传代及冻存

2.2.2 PEDV的增殖

50 测定'> 2.2.3 PEDV TCID₅₀测定

2.2.4 PEDV的接毒以及样品制备

2.2.5 PEDV感染Vero细胞的病变观察

2.2.6 间接免疫荧光观察p53 的变化以及PEDV感染

2.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡

2.2.8 ROS的检测

2.2.9 Western blot检测

2.2.10 数据分析

2.3 结果

2.3.1 PEDV感染Vero细胞病变观察

2.3.2 IFA确定PEDV感染情况

2.3.3 PEDV感染对细胞凋亡的影响

2.3.4 PEDV感染对p53 的影响

2.3.5 PEDV感染对MAPK家族的影响

2.3.6 PEDV感染对ROS的影响

2.4 讨论

2.5 小结

第三章活化的凋亡信号与PEDV诱导凋亡的相关性研究

3.1 材料

3.1.1 细胞、病毒与抗体

3.1.2 试剂

3.1.3 主要仪器设备

3.1.4 相关试剂的配制

3.2 方法

3.2.1 抑制试验

3.2.2 Western blot检测抑制剂/抗氧化剂作用下的凋亡蛋白变化

3.2.3 流式细胞仪检测抑制剂/抗氧化剂作用下的细胞凋亡

3.2.4 流式细胞仪检测抑制剂/抗氧化剂作用下的ROS生成量

3.2.5 MTT法检测抑制剂/抗氧化剂的细胞毒性

3.3 结果

3.3.1 抑制p53 对细胞凋亡以及凋亡蛋白的影响

3.3.2 抑制p38 MAPK,SAPK/JNK对凋亡相关蛋白的影响

3.3.3 使用抗氧化剂处理对凋亡以及凋亡蛋白的影响

3.3.4 分别使用抗氧化剂、p53 抑制剂处理对p53 以及ROS含量的影响

3.3.5 MTT试验检测各分子抑制剂对细胞活性的抑制作用

3.4 讨论

3.5 小结

第四章结论

参考文献

致谢

个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 徐滢

导师: 李勤凡,许信刚

关键词: 猪流行性腹泻病毒,凋亡,活性氧

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: 2018年杨凌示范区科技计划项目(2018NY-10),西安市农业科技创新计划(研发类)(2017050NC,NY010)

分类号: S852.651

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