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槐耳漆酶的分离纯化及其介体系统对活性染料降解研究

2020-12-10阅读(874)

槐耳漆酶的分离纯化及其介体系统对活性染料降解研究

论文摘要

漆酶是一种多酚氧化酶,广泛分布于植物、真菌、细菌、昆虫等中,它作用底物广泛,能够催化木质素、酚类、胺类等芳香族、非芳香族化合物氧化分解,其氧化过程不产生对环境污染的副产物,因此称其为“绿色催化剂”,被广泛应用于环境保护、造纸、纺织、食品加工、药品改良以及生物监测领域。漆酶与某些小分子化合物结合构成的漆酶介体系统（LMS）对于环境保护和木质素降解等方面更具应用价值。本研究以采集自加拿大杨（Populus canadensis）上的野生槐耳XS-01为实验材料,进行菌株分离、鉴定、菌丝最适培养条件、产漆酶发酵条件、漆酶的分离纯化、酶学性质、克隆及漆酶介体系统对活性染料的降解等实验。具体研究结果如下:1.结合形态学分析与ITS鉴定确定XS-01菌株为槐生多年卧孔菌（Perenniporia robiniophila）,其菌丝生长的最适碳源为淀粉和麦芽糖,最适氮源为酵母浸粉,最适生长因子为VB1,最适C/N比区间为30/1-60/1,最适温度为32℃,最适生长pH为pH 7。其发酵的最适产漆酶条件为:PD培养基、5%接种量、1.0 mmol/L CuSO4,28℃恒温摇床上培养96 h,获得最大酶活,为8.3×104104 IU/mL。2.利用发酵培养基对XS-01菌株进行发酵漆酶,将发酵液经离心过滤后获得的粗酶液,再经DEAE-Sepharose、SP-Sepharose、Q-Sepharose以及Superdex 75凝胶过滤层析分离纯化后获得纯化漆酶,结合SDS-PAGE和凝胶过滤层析可以确定XS-01漆酶为66 kDa的单亚基蛋白,回收率为3.19%,纯化倍数为70.49倍。在漆酶的性质实验中,确定其最适温度为50-60℃,在50℃和60℃下具有很好的稳定性;最适pH为2.2,而在pH 2.2-2.6时稳定性较差,孵育1 h漆酶活性衰减40-53%。在50℃、pH 2.2、底物为ABTS条件下,测定Km为54.3μmol/L,Vmax为5.8μmol/min。在不同金属离子对漆酶活性的影响实验中,除K+和Na+对漆酶无明显抑制作用外,其余金属离子（1.25-10 mmol/L）均有抑制作用,其中Fe3+的抑制作用最高,反应1 h后,1.25 mmol/L的Fe3+能抑制漆酶51.22%的活性。以CuⅠ和CuⅣ作为引物对漆酶核心区进行扩增,获得核心区部分序列,长度为859 bp,与污叉丝孔菌（Dichomitus squalens）LYAD-421 SS1漆酶序列相似性最高,为74.63%。3.对于活性染料降解实验结果表明,纯漆酶对活性艳蓝、活性黑和活性艳橙降解2 h后降解率分别为27%、10%和2%。乙酰丁香酮（AS）和丁香醛（SA）与漆酶构成的漆酶介体系统为活性艳蓝、活性黑以及活性艳橙漆酶的最适介体系统,其最适反应条件为,50℃、pH 5.0、介体浓度0.1 mmol/L,反应0.5 h,L+AS对活性艳蓝、黑和艳橙的降解率分别达到了75%、79%和91%,L+SA对3种染料的降解率分别为65%、77%和92%。以黑麦草、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌为目标对3种染料在最适条件下的降解产物进行毒性检测,最终发现3种活性染料降解后的产物对2种细菌无明显毒性。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略词
  • 第一章 绪论
  •   1.1 漆酶研究进展
  •     1.1.1 漆酶的简介
  •     1.1.2 漆酶的来源与功能
  •     1.1.3 真菌漆酶的结构与反应机理
  •     1.1.4 漆酶分离纯化方法
  •     1.1.5 漆酶性质
  •     1.1.6 漆酶的基因克隆
  •     1.1.7 漆酶的应用
  •   1.2 漆酶/介体系统（LMS）
  •     1.2.1 LMS的定义与特点
  •     1.2.2 介体的类型
  •     1.2.3 LMS的反应机理
  •   1.3 LMS的多领域应用
  •     1.3.1 造纸领域应用
  •     1.3.2 纺织领域的应用
  •     1.3.3 环保领域的应用
  •   1.4 槐耳简介
  •   1.5 立项依据与研究内容
  •     1.5.1 立项依据
  •     1.5.2 研究内容
  •     1.5.3 技术路线图
  • 第二章 槐耳的分离鉴定、最适培养条件及产酶条件研究
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌株
  •     2.1.2 培养基
  •   2.2 实验药品与溶液
  •     2.2.1 实验药品
  •     2.2.2 溶液与试剂盒
  •   2.3 实验仪器
  •   2.4 实验方法
  •     2.4.1 菌株的分离与保存
  •     2.4.2 分子鉴定
  •     2.4.3 最适培养条件研究
  •     2.4.4 最适产酶条件研究
  •     2.4.5 酶活性测定方法
  •   2.5 实验结果
  •     2.5.1 形态学鉴定
  •     2.5.2 分子鉴定
  •     2.5.3 最适培养条件研究
  •     2.5.4 最适产酶条件研究
  •   2.6 分析与讨论
  •   2.7 本章小结
  • 第三章 XS-01 菌株胞外漆酶的分离纯化、酶学性质及基因克隆
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 实验菌株
  •     3.1.2 培养基
  •   3.2 实验试剂
  •     3.2.1 漆酶分离纯化试剂
  •     3.2.2 漆酶酶学性质实验试剂
  •   3.3 实验仪器
  •   3.4 实验方法
  •     3.4.1 粗酶液的发酵和粗分离
  •     3.4.2 离子交换层析
  •     3.4.3 凝胶过滤层析
  •     3.4.4 SDS-PAGE
  •     3.4.5 漆酶N-端测序
  •     3.4.6 漆酶肽段测序
  •     3.4.7 漆酶酶学性质
  •     3.4.8 RNA提取与cDNA合成
  •     3.4.9 漆酶核心区域克隆
  •     3.4.10 PCR后产物纯化
  •     3.4.11 漆酶全基因克隆
  •   3.5 实验结果
  •     3.5.1 DEAE-Sepharose分离结果
  •     3.5.2 SP-Sepharose分离结果
  •     3.5.3 Q-Sepharose分离结果
  •     3.5.4 Superdex75 凝胶过滤层析分离结果
  •     3.5.5 分离纯化效率
  •     3.5.6 SDS-PAGE检测
  •     3.5.7 XS-01 漆酶肽段序列
  •     3.5.8 XS-01 N-端序列
  •     3.5.9 XS-01 漆酶酶学性质
  •     3.5.10 RNA提取与漆酶核心区扩增
  •     3.5.11 XS-01 漆酶全基因克隆
  •   3.6 分析与讨论
  •   3.7 本章小结
  • 第四章 漆酶/介体系统对活性染料降解研究
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 纯化后漆酶（OD420=1.0,8.9x104 IU/mL）
  •     4.1.2 细菌菌株
  •     4.1.3 培养基
  •   4.2 实验试剂
  •     4.2.1 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液
  •     4.2.2 介体
  •     4.2.3 活性染料
  •   4.3 实验仪器
  •   4.4 实验方法
  •     4.4.1 介体的筛选与LMS的构建
  •     4.4.2 不同温度对LMS降解活性染料的影响
  •     4.4.3 不同pH对 LMS降解活性染料的影响
  •     4.4.4 不同介体浓度对LMS降解活性染料的影响
  •     4.4.5 最适条件下LMS对于活性染料的降解
  •     4.4.6 基于全波段扫描对活性染料降解机理的研究
  •     4.4.7 降解后产物对黑麦草的毒性研究
  •     4.4.8 降解后产物对细菌的毒性研究
  •   4.5 实验结果
  •     4.5.1 介体的筛选与漆酶/介体系统（LMS）的构建
  •     4.5.2 温度对于LMS降解活性染料的影响
  •     4.5.3 pH对于LMS降解活性染料的影响
  •     4.5.4 介体浓度LMS降解活性染料的影响
  •     4.5.5 最适条件下LMS对于活性染料的降解
  •     4.5.6 基于全段扫描探究LMS对活性染料的降解机理
  •     4.5.7 降解后产物对黑麦草的毒性
  •     4.5.8 降解后产物对细菌的毒性
  •   4.6 分析与讨论
  •   4.7 本章小结
  • 第五章 实验结论与进一步工作
  •   5.1 结论
  •   5.2 进一步工作
  • 致谢
  • 附录
  • 个人简介

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 徐鑫

    导师: 张国庆,张国栋

    关键词: 槐生多年卧孔菌,漆酶,分离纯化,克隆,染料降解

    来源: 北京农学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,环境科学与资源利用

    单位: 北京农学院

    分类号: X703;Q814.1

    总页数: 113

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