导读:本文包含了汉滩病毒结构蛋白论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:病毒,蛋白,免疫,细胞,包膜,结构,抗原。
汉滩病毒结构蛋白论文文献综述
马樱,唐康,张宇丝,张春梅,张赟[1]（2017）在《汉滩病毒结构蛋白串联抗原表位的分子设计及免疫原性评价》一文中研究指出背景:肾综合征出血热(HFRS)是全球广泛分布且危害极大的一种急性传染病。在我国,由汉滩病毒(HTNV)感染引起的HFRS发病率高且死亡率高达15%。目前国内外成功上市的HFRS疫苗均为灭活全病毒疫苗,在预防疾病发生和流行方面起着积极作用,但仍存在刺激机体细胞免疫应答作用弱、诱导产生中和抗体滴度不理想等间题。目的:表位疫苗是基于抗原表位氨基酸序列而制备的一种新型分子疫苗,其安全性好、保护力强并且应答类型可以有效调控,研究HFRS新型表位疫苗具有重要的理论和实际意义。方法:设计基于HTNV HLA-A2限制CTL表位、B细胞表位和通用Th细胞表位的串联体候选疫苗分子。利用HLA-A2.1/K~b转基因小鼠体内HTNV复制模型进行攻毒实验,检测串联表位肽免疫后的小鼠各器官组织悬液中HTNV特异性抗原及RNA病毒载量。结果:在前期鉴定HLA-A2限制性HTNV-Gn/Gc 9肽CTL表位的基础上,通过选择HLA-A2限制的HTNV糖蛋白CTL表位VMASLVWP(VV9)、具有中和活性的HTNV B细胞表位GFLCPEFPGSFRKKC(GC15)及通用Th表位PADRE(AKXVAAWTLKAAA),设计出的串联表位"Th~+CTL"或"B~+Th~+CTL",尤其是"B~+Th~+CTL",与VV9单一CTL表位相比,串联表位肽在HLA-A2.1/K~b转基因小鼠体内可诱导表位特异性CTL产生更高水平IFN-γ,更高频率杀伤介质以及诱导更强烈的特异性CTL增殖的能力。结论:多肽分子内设计"B~+Th"表位肽段对CTL功能发挥的重要辅助作用,串联表位肽的序列及构建方案可作为HTNV多肽疫苗设计研究的候选疫苗分子,可为设计新型HTNV表位肽疫苗提供重要的理论和实验依据。(本文来源于《第十二届全国免疫学学术大会摘要汇编》期刊2017-10-26）
于澜[2]（2014）在《糖基化对汉滩病毒包膜糖蛋白重组假病毒糖链结构及生物学特性影响的初步研究》一文中研究指出汉坦病毒（Hantavirus）可引起两种急性病毒性传染病：一种是汉坦病毒肺综合征（Hantavirus pulmonary syndrome，HPS），另一种是肾综合征出血热（hemorrhagicfever with renal syndrome, HFRS）。其中，HFRS在我国流行范围广，发病率高，病死率也较高；另外，HFRS的传染源和宿主动物广泛，可通过多种途径传播，其防治任务十分艰巨。但由于HFRS的发病机制较为复杂，有些环节尚未研究清楚，使临床缺乏特效治疗药物，目前使用的灭活疫苗也存在不足，因此加强汉坦病毒相关的基础研究十分必要。汉坦病毒包膜糖蛋白（Glycoprotein，GP）能诱导病毒与宿主细胞发生膜融合，能刺激机体产生中和抗体，对感染动物或HFRS患者有一定的保护作用，与病毒的致病性及诱发机体产生抗病毒免疫等均有密切关系，是汉坦病毒研究中最受关注的蛋白之一。汉坦病毒Gn、Gc上均存在保守的N-糖基化位点。国内外对一些病毒的研究表明，N-糖基化对糖蛋白自身的转运、折迭，对抗原决定簇的结构、功能以及对病毒颗粒的成熟、毒力和免疫逃避等均有重要作用。但目前对汉坦病毒GP糖基化的研究仍仅限于糖基化对GP本身蛋白的正确折迭及其与细胞膜融合作用的影响，而对GP糖蛋白糖链的结构、抗原性、免疫原性及对病毒感染性的影响仍不清楚。针对以上问题，本实验利用基因重组技术，对汉滩病毒（Hantaan virus，HTNV）76-118株GP上的N-糖基化位点分别进行突变后构建重组假病毒，利用凝集素芯片技术对各重组假病毒糖蛋白的糖链结构进行了初步分析；通过对各重组假病毒感染Vero-E6细胞能力的比较研究了糖基化位点对病毒感染性的影响；并用重组假病毒免疫小鼠，通过检测免疫小鼠的体液免疫、细胞免疫应答水平及其对HTNV感染的保护作用等，评价了糖基化位点对GP免疫原性的影响。【研究方法及结果】一、含汉滩病毒M基因或其糖基化位点突变基因重组假病毒的构建及其糖链结构的比较研究1．采用定点突变的方法，分别突变了HTNV76-118株GP的5个N-糖基化位点（Gn的N134Q、N235Q、N347Q、N399Q和Gc的N928Q），分别构建了含有上述突变位点和非突变位点的真核表达载体，与包装质粒共同转染293T细胞后，获得了含有GFP报告基因的糖基化位点突变株（rLV-M1、rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4、rLV-M5）和非突变株（rLV-M）共6株HTNV重组假病毒。2．用凝集素芯片对6株重组假病毒糖蛋白糖链结构进行检测，结果显示：rLV-M与WFA、STL、BS-I、DSA、WGA5种凝集素的结合信号为阳性；rLV-M1与STL、BS-I、DSA、WGA4种凝集素的结合信号为阳性；rLV-M2与STL、BS-I、DSA、WGA、NPL、PTL-II6种凝集素的结合信号为阳性；rLV-M3与WFA、STL、BS-I、DSA、NPL、PTL-II6种凝集素的结合信号为阳性；rLV-M4与STL、BS-I、DSA3种凝集素的结合信号为阳性；rLV-M5与AAL、GSL-I、STL、BS-I、DSA、BPL、NPL、PTL-II8种凝集素的结合信号为阳性。3．根据凝集素识别糖链的特异性不同，推测出不同的重组假病毒上存在有不同的糖链结构：rLV-M上主要为GalNAcβ1,4GlcNAc、GlcNAc、α-Gal、α-GalNAc、Multivalent Sia、（GlcNAc）n、β1-4GlcNAc和LacNAc糖链结构；rLV-M1上主要为GlcNAc、α-Gal、α-GalNAc、Multivalent Sia、（GlcNAc）n、β1-4GlcNAc和LacNAc糖链结构；rLV-M2上主要为Non-substitutedα-1,6Man、α-Gal、α-GalNAc、GlcNAc、Multivalent Sia、（GlcNAc）n、β1-4GlcNAc、LacNAc和Gal糖链结构；rLV-M3上主要为GalNAcβ1,4GlcNAc、Non-substitutedα-1,6Man、α-Gal、α-GalNAc、GlcNAc、Gal、β1-4GlcNAc和LacNAc糖链结构； rLV-M4上主要为GlcNAc、β1-4GlcNAc、LacNAc、α-Gal和α-GalNAc糖链结构；rLV-M5上主要为GlcNAc、β1-4GlcNAc、LacNAc、α-Gal、α-GalNAc、fucose、Galβ1-3GalNAc、Gal、Non-substitutedα-1,6Man和GalNAcα-Ser/Thr（Tn）糖链结构。与rLV-M相比较，rLV-M2、LV-M3、rLV-M5均增加了Gal和Non-substitutedα-1,6Man糖链结构，rLV-M5还增加了Fucose、GalNAcα-Ser/Thr（Tn）、Galβ1-3GalNAc糖链结构；而rLV-M1、rLV-M2、rLV-M4、rLV-M5均减少了GalNAcβ-1,4GlcNAc糖链结构，rLV-M3、rLV-M4、rLV-M5则都减少了Multivalent Sia、（GlcNAc）n糖链结构。4．对与所有重组假病毒结合信号均为阳性的STL、BS-I、DSA3种凝集素的荧光信号强度进行比较，结果显示：与rLV-M相比，rLV-M1与STL、BS-I、DSA3种凝集素结合的荧光信号均明显增强（P＜0.05）；rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4与BS-I结合的荧光信号明显增强（P＜0.05）；而rLV-M2、rLV-M3、 rLV-M4、rLV-M5与DSA结合的荧光信号均明显减弱（P＜0.05），其余均无明显区别。说明在rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4中α-Gal和α-GalNAc糖链结构的丰度高于rLV-M，在rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4、rLV-M5中β1-4GlcNAc和LacNAc糖链结构的丰度低于rLV-M，而在rLV-M1中LacNAc、α-Gal、α-GalNAc、β1-4GlcNAc和GlcNAc糖链结构的丰度均高于rLV-M。二、含汉滩病毒M基因或其糖基化位点突变基因的重组假病毒感染性及免疫学特性比较研究1．取6株重组假病毒以相同滴度分别感染Vero-E6细胞后，荧光显微镜下可见各株重组假病毒感染的细胞均有明显的绿色荧光。进一步用流式细胞仪对感染细胞进行GFP检测，结果显示：rLV-M株的GFP阳性细胞含量为57.2%；rLV-M3株为66.4%，比rLV-M株增加了约10%的感染性；rLV-M1株和rLV-M2株分别为45.9%和48.5%，均比rLV-M株降低了约10%的感染性；rLV-M4株为38.5%，比rLV-M株降低了约20%的感染性；rLV-M5株最低，为28.1%，比rLV-M株降低了约50%的感染性。结合前述糖链结构检测结果进一步分析后提示，改变的糖链结构可能影响了GP上病毒吸附蛋白（VAP）的构象或糖蛋白本身的正确折迭，从而引起病毒感染性的改变；新增糖链的数量越多、结构越复杂，病毒的感染性越低；GalNAcβ-1,4GlcNAc糖链结构的存在是感染性高低的重要决定因素之一。2．将6株组重组假病毒通过肌肉注射免疫C57BL/6小鼠，以空载体、生理盐水及HFRS灭活疫苗为对照，通过ELISA及微量细胞培养中和试验对各组小鼠体液免疫应答的情况进行了检测。ELISA结果显示，rLV-M、rLV-M1、rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4及rLV-M5分别免疫的小鼠血清中均可检测出抗HTNV GP的特异性抗体，其几何平均滴度（GMT）分别为134.5、123.4、134.5、134.5、123.4和134.5，各组间无显着差异（P＞0.05）；灭活疫苗对照组小鼠血清中抗GP抗体的GMT为146.7，与各实验组间亦无显着差异（P＞0.05）。微量细胞培养中和试验结果显示，rLV-M、rLV-M1、rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4及rLV-M5分别免疫的小鼠血清中均可检测出中和抗体，其GMT分别为103.8、103.8、95.1、113.1、95.1和87.2，各组间无显着差异（P＞0.05），但均高于GMT为16.8的灭活疫苗对照组（P＜0.05）。3．通过ELISPOT的方法对各组免疫小鼠脾细胞分泌INF-γ、IL-2、IL-10及IL-4的水平进行了检测。结果表明，各重组假病毒免疫组小鼠分泌INF-γ、IL-2、IL-10及IL-4的水平均无显着差异（P＞0.05），且均高于生理盐水对照组小鼠（P＜0.05）；各重组假病毒免疫组小鼠分泌INF-γ、IL-2的水平均低于灭活疫苗对照组小鼠（P＜0.05），而与rLV-ZsGreen对照组小鼠无显着差异（P＞0.05）；各重组假病毒免疫组小鼠分泌IL-4、IL-10的水平与疫苗对照组之间无显着差异（P＞0.05），且均高于rLV-ZsGreen对照组小鼠（P＜0.05）。细胞因子检测结果表明，所有含HTNV GP的重组假病毒均可刺激小鼠脾细胞分泌IL-4、IL-10水平增高，而分泌INF-γ、IL-2水平与rLV-ZsGreen对照组无明显的差别，提示含HTNV GP的重组假病毒作为免疫原诱导宿主体内产生了以体液免疫为主的应答，且突变株与非突变株重组假病毒之间没有明显的差异。4．用HTNV76-118病毒株对上述各组免疫的C57BL/6小鼠进行病毒攻击后，ELISA双抗体夹心法对各组小鼠肝脏和脾脏中HTNV抗原检测结果表明，与rLV-ZsGreen对照组和生理盐水对照组相比，采用各重组假病毒免疫小鼠，对HTNV的感染均有一定的保护作用（P＜0.05），而各重组假病毒组之间的保护作用无显着差异（P＞0.05）；各重组假病毒免疫组对小鼠的保护作用均弱于灭活疫苗免疫组（P＜0.05）。【结论】本研究采用定点突变的方法，成功获得了含有GFP报告基因的糖基化位点突变株（rLV-M1、rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4、rLV-M5）和非突变株（rLV-M）共6株HTNV重组假病毒。凝集素芯片检测结果表明，HTNV Gn及Gc上每一个糖基化位点的变化均引起了重组假病毒自身糖链结构的改变；进一步结合感染性检测结果分析提示，改变的糖链结构可能影响了HTNV GP上VAP的构象或糖蛋白本身的正确折迭，从而引起重组假病毒感染性的改变；新增糖链的数量越多、结构越复杂，重组假病毒的感染性越低；GalNAcβ-1,4GlcNAc糖链结构的存在是重组假病毒感染性高低的重要决定因素之一，提示通过限制或修饰该糖链结构很可能影响重组假病毒对靶细胞的感染性，从而为HTNV的防治提供新的靶向分子。动物实验结果显示，所有含HTNV GP的重组假病毒免疫的小鼠均可以引起体液免疫为主的HTNV特异性免疫应答，能够产生较高滴度的中和抗体且对小鼠感染HTNV有一定的保护作用。但由于改变的糖链结构可能没有位于HTNV主要抗原表位的附近，或突变单个糖基化位点引起的糖链结构的改变对抗原表位的整体空间结构影响不大，因此单个糖基化位点的突变对GP的免疫原性并没有明显的影响。此外，构建的含有HTNV GP的重组假病毒能够诱导机体产生较高滴度的中和抗体，也为我们进一步优化汉坦病毒基因工程疫苗的设计提供了良好的思路和实验依据。(本文来源于《第四军医大学》期刊2014-05-01）
闫果林[3]（2011）在《汉滩病毒结构蛋白线性B细胞表位的筛选和鉴定》一文中研究指出肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）是由汉坦病毒（hantavirus，HTV）引起的以鼠类为主要传染源的一种自然疫源性疾病，又称流行性出血热（epidemic hemorrhagic fever，EHF），简称出血热。全球每年新发病例有90%左右在中国；死亡率在2%~10%左右。该病在我国绝大多数省区流行，病情危急，危害很大。汉滩病毒（hantaan virus， HTNV）和汉城病毒（Seoul virus， SEOV）是我国HFRS的两种主要病原体。汉坦病毒感染可引起机体明显的适应性免疫应答。体液免疫应答强烈而持久；细胞免疫可能在免疫保护和免疫病理损伤两方面都有作用。汉坦病毒核蛋白是诱导体液免疫应答主要的免疫原，可在发病数天内引起抗体应答。因此，重组核蛋白常被用来检测患者血清中病毒特异性抗体的类型和水平，为HFRS的诊断提供依据。糖蛋白免疫原性较弱，糖蛋白特异性抗体出现稍晚，多在病程中后期。但是，一般认为汉坦病毒糖蛋白是诱导中和抗体产生的主要来源；而据报道，中和抗体出现的早晚与患者的病情及预后密切相关。人感染汉坦病毒后，血清病毒特异性IgG水平随时间延长不断升高，一般于恢复早期达到平台期；持续时间长，有时在病愈后数十年仍可检测到。抗体的产生离不开抗原特异性B细胞的活化、增殖、分化；抗原特异性B细胞接触并结合抗原是体液免疫应答的始动环节；而这离不开B细胞受体（B cell receptor, BCR）对抗原的有效识别。抗原与BCR相互识别、发生作用的结构叫做抗原决定簇（antigenic determinants），又称表位(epitope)。表位是抗原与抗体发生作用的主要部位，是抗体识别抗原的结构基础。研究汉坦病毒结构蛋白特异性抗体识别的B细胞表位对于深入认识病毒致病和抗体产生机制，中和抗体的免疫保护作用，以及研发新的诊断材料、亚单位疫苗等具有重要意义。目前，有关汉滩病毒结构蛋白B细胞表位的报道较少，尚缺乏系统的研究。本论文首次采用合成的重迭多肽对HFRS患者血清抗体识别的HTNV核蛋白（nucleocapsid protein，NP）线性B细胞表位进行了系统分析。把覆盖HTNV NP氨基酸全序列的70条重迭15肽包被于ELISA板，用间接ELISA法筛选了35例HFRS患者血清抗体识别的线性B细胞表位，并用竞争ELISA证实了患者血清抗体与抗原肽结合的特异性。发现HFRS患者血清抗体识别的线性B细胞表位主要在NP氨基端（aa1-117），其次为NP羧基端（aa361-429），在NP氨基酸序列的中部仅有数个线性B细胞表位。发现一些患者血清抗原肽特异性IgG水平在急性期可有不同的变化。同时，我们合成了覆盖HTNV GP氨基酸全序列的281条重迭15肽，利用间接ELISA和点杂交两种PepScan法对3D8、3G1、8G3这3株鼠源性中和抗体识别的B细胞表位进行表位作图。首先，将合成的281条重迭多肽分成28组，每10条肽为一组，混合后包被于ELISA板或者NC膜上，用上述3株单克隆抗体做粗筛；然后将与单克隆抗体呈阳性反应的混合肽中各组成肽分别包被ELISA板或NC膜继续用单克隆抗体反应，做细筛，从而确定各单克隆抗体识别的抗原肽。然后用竞争ELISA证实抗原肽与中和抗体结合的特异性。我们发现单克隆抗体3D8和8G3识别HTNV GP抗原肽881-KGFLCPEFPGSFRKK-895，而单克隆抗体3G1可能识别由数个线性肽组成的构象表位。由于原合成肽相邻肽间相差4个氨基酸残基，因此又追加合成了与881-KGFLCPEFPGSFRKK-895分别相差3个、2个、1个氨基酸残基的15肽。将这些肽包被于ELISA板或NC膜上与单克隆抗体3D8反应，进行单克隆抗体3D8识别线性B细胞表位的精细定位。我们发现单克隆抗体3D8与882-GFLCPEFPGSFRKKC-896反应最强烈。接着，用丙氨酸扫描突变法分析882-GFLCPEFPGSFRKKC-896这条抗原肽发挥主要作用的氨基酸残基，发现aa885C、aa896C是该抗原肽表位最关键的氨基酸残基，aa882G、aa883F、aa884L、aa893R、aa894K、aa895K对单克隆抗体3D8识别这个抗原肽表位也有重要影响。本论文首次系统分析了肾综合征出血热患者血清抗体识别的HTNV核蛋白线性B细胞表位，对具有中和作用的单克隆抗体3D8的B细胞表位作图确定了汉滩病毒糖蛋白上一个新的中和表位。这一结果不仅为深入探讨HTNV感染引起的体液免疫应答规律以及研制新型疫苗提供了理论依据，同时为搞清单克隆抗体3D8作为HFRS治疗性抗体的抗病毒感染机制提供了重要的实验依据。(本文来源于《第四军医大学》期刊2011-04-01）
高娟,杨守京,刘彦仿[4]（2004）在《汉滩病毒结构蛋白与该病毒感染诱导表达的多种热休克蛋白的研究》一文中研究指出目的研究汉滩病毒(HTNV)感染乳鼠诱导其脑组织表达热休克蛋白(HSPs)及其与病毒结构蛋白的相互关系。方法选出生2～3d的昆明乳鼠实验性感染HTNV,取感染后8d的乳鼠脑组织制成组织匀浆液,用双特异性抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)及免疫共沉淀方法分析病毒核衣壳蛋白(HTNVNP)和囊膜糖蛋白G2(HTNVG2)与94000葡萄糖调节蛋白(GRP94)、HSP70、HSP27叁种HSPs的关系。结果HTNV感染乳鼠诱导其脑组织表达GRP94、HSP70;HTNVNP同时与GRP94、HSP70、HSP27相互作用,呈复合物形式存在;HTNVG2也与HTNVNP和HSP27存在相互作用,形成HTNVG2NPHSP27非共价复合物。结论HTNV感染可诱导表达多种HSPs,这些HSPs同时与病毒结构蛋白发生相互作用形成非共价复合物,表明在病毒感染和病毒结构蛋白的合成、转运等过程中有多种HSPs伴侣分子的参与,其相互作用机制有待进一步研究。(本文来源于《中华传染病杂志》期刊2004年05期）
罗雯,徐志凯,张芳琳,阎岩,吴兴安[5]（2002）在《汉滩病毒结构蛋白昆虫细胞融合表达产物的免疫原性评价》一文中研究指出目的 研究汉滩病毒 (HTNV)囊膜糖蛋白G1与核蛋白 (NP)部分片段在昆虫细胞中融合表达产物的免疫学特性 ,为HTNV基因工程疫苗的研制提供依据。方法 构建含有HTNVG1S0 .7嵌合基因的重组杆状病毒Bac G1S0 .7,用其感染的Sf9细胞免疫Balb c小鼠。用间接免疫荧光法、ELISA法、微量细胞培养中和试验及T淋巴细胞增殖试验对被免疫小鼠的体液免疫及细胞免疫应答效果进行检测。结果 Bac G1S0 .7感染的昆虫细胞免疫小鼠后 ,测得免疫鼠血清抗HTNV抗体滴度最高达 1∶3 2 0 0 ,含有特异性抗HTNVNP及抗HTNV糖蛋白G1的抗体 ,被免疫小鼠中有部分产生了较低滴度的中和抗体 ,免疫鼠脾细胞对HTNVNP或糖蛋白的增殖反应指数均高于阴性对照组。结论 G1S0 .7嵌合基因的昆虫细胞表达产物具有较好的免疫原性 ,可刺激机体同时产生针对HTNVNP与囊膜糖蛋白G1的细胞及体液免疫应答(本文来源于《免疫学杂志》期刊2002年06期）
汉滩病毒结构蛋白论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
汉坦病毒（Hantavirus）可引起两种急性病毒性传染病：一种是汉坦病毒肺综合征（Hantavirus pulmonary syndrome，HPS），另一种是肾综合征出血热（hemorrhagicfever with renal syndrome, HFRS）。其中，HFRS在我国流行范围广，发病率高，病死率也较高；另外，HFRS的传染源和宿主动物广泛，可通过多种途径传播，其防治任务十分艰巨。但由于HFRS的发病机制较为复杂，有些环节尚未研究清楚，使临床缺乏特效治疗药物，目前使用的灭活疫苗也存在不足，因此加强汉坦病毒相关的基础研究十分必要。汉坦病毒包膜糖蛋白（Glycoprotein，GP）能诱导病毒与宿主细胞发生膜融合，能刺激机体产生中和抗体，对感染动物或HFRS患者有一定的保护作用，与病毒的致病性及诱发机体产生抗病毒免疫等均有密切关系，是汉坦病毒研究中最受关注的蛋白之一。汉坦病毒Gn、Gc上均存在保守的N-糖基化位点。国内外对一些病毒的研究表明，N-糖基化对糖蛋白自身的转运、折迭，对抗原决定簇的结构、功能以及对病毒颗粒的成熟、毒力和免疫逃避等均有重要作用。但目前对汉坦病毒GP糖基化的研究仍仅限于糖基化对GP本身蛋白的正确折迭及其与细胞膜融合作用的影响，而对GP糖蛋白糖链的结构、抗原性、免疫原性及对病毒感染性的影响仍不清楚。针对以上问题，本实验利用基因重组技术，对汉滩病毒（Hantaan virus，HTNV）76-118株GP上的N-糖基化位点分别进行突变后构建重组假病毒，利用凝集素芯片技术对各重组假病毒糖蛋白的糖链结构进行了初步分析；通过对各重组假病毒感染Vero-E6细胞能力的比较研究了糖基化位点对病毒感染性的影响；并用重组假病毒免疫小鼠，通过检测免疫小鼠的体液免疫、细胞免疫应答水平及其对HTNV感染的保护作用等，评价了糖基化位点对GP免疫原性的影响。【研究方法及结果】一、含汉滩病毒M基因或其糖基化位点突变基因重组假病毒的构建及其糖链结构的比较研究1．采用定点突变的方法，分别突变了HTNV76-118株GP的5个N-糖基化位点（Gn的N134Q、N235Q、N347Q、N399Q和Gc的N928Q），分别构建了含有上述突变位点和非突变位点的真核表达载体，与包装质粒共同转染293T细胞后，获得了含有GFP报告基因的糖基化位点突变株（rLV-M1、rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4、rLV-M5）和非突变株（rLV-M）共6株HTNV重组假病毒。2．用凝集素芯片对6株重组假病毒糖蛋白糖链结构进行检测，结果显示：rLV-M与WFA、STL、BS-I、DSA、WGA5种凝集素的结合信号为阳性；rLV-M1与STL、BS-I、DSA、WGA4种凝集素的结合信号为阳性；rLV-M2与STL、BS-I、DSA、WGA、NPL、PTL-II6种凝集素的结合信号为阳性；rLV-M3与WFA、STL、BS-I、DSA、NPL、PTL-II6种凝集素的结合信号为阳性；rLV-M4与STL、BS-I、DSA3种凝集素的结合信号为阳性；rLV-M5与AAL、GSL-I、STL、BS-I、DSA、BPL、NPL、PTL-II8种凝集素的结合信号为阳性。3．根据凝集素识别糖链的特异性不同，推测出不同的重组假病毒上存在有不同的糖链结构：rLV-M上主要为GalNAcβ1,4GlcNAc、GlcNAc、α-Gal、α-GalNAc、Multivalent Sia、（GlcNAc）n、β1-4GlcNAc和LacNAc糖链结构；rLV-M1上主要为GlcNAc、α-Gal、α-GalNAc、Multivalent Sia、（GlcNAc）n、β1-4GlcNAc和LacNAc糖链结构；rLV-M2上主要为Non-substitutedα-1,6Man、α-Gal、α-GalNAc、GlcNAc、Multivalent Sia、（GlcNAc）n、β1-4GlcNAc、LacNAc和Gal糖链结构；rLV-M3上主要为GalNAcβ1,4GlcNAc、Non-substitutedα-1,6Man、α-Gal、α-GalNAc、GlcNAc、Gal、β1-4GlcNAc和LacNAc糖链结构； rLV-M4上主要为GlcNAc、β1-4GlcNAc、LacNAc、α-Gal和α-GalNAc糖链结构；rLV-M5上主要为GlcNAc、β1-4GlcNAc、LacNAc、α-Gal、α-GalNAc、fucose、Galβ1-3GalNAc、Gal、Non-substitutedα-1,6Man和GalNAcα-Ser/Thr（Tn）糖链结构。与rLV-M相比较，rLV-M2、LV-M3、rLV-M5均增加了Gal和Non-substitutedα-1,6Man糖链结构，rLV-M5还增加了Fucose、GalNAcα-Ser/Thr（Tn）、Galβ1-3GalNAc糖链结构；而rLV-M1、rLV-M2、rLV-M4、rLV-M5均减少了GalNAcβ-1,4GlcNAc糖链结构，rLV-M3、rLV-M4、rLV-M5则都减少了Multivalent Sia、（GlcNAc）n糖链结构。4．对与所有重组假病毒结合信号均为阳性的STL、BS-I、DSA3种凝集素的荧光信号强度进行比较，结果显示：与rLV-M相比，rLV-M1与STL、BS-I、DSA3种凝集素结合的荧光信号均明显增强（P＜0.05）；rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4与BS-I结合的荧光信号明显增强（P＜0.05）；而rLV-M2、rLV-M3、 rLV-M4、rLV-M5与DSA结合的荧光信号均明显减弱（P＜0.05），其余均无明显区别。说明在rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4中α-Gal和α-GalNAc糖链结构的丰度高于rLV-M，在rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4、rLV-M5中β1-4GlcNAc和LacNAc糖链结构的丰度低于rLV-M，而在rLV-M1中LacNAc、α-Gal、α-GalNAc、β1-4GlcNAc和GlcNAc糖链结构的丰度均高于rLV-M。二、含汉滩病毒M基因或其糖基化位点突变基因的重组假病毒感染性及免疫学特性比较研究1．取6株重组假病毒以相同滴度分别感染Vero-E6细胞后，荧光显微镜下可见各株重组假病毒感染的细胞均有明显的绿色荧光。进一步用流式细胞仪对感染细胞进行GFP检测，结果显示：rLV-M株的GFP阳性细胞含量为57.2%；rLV-M3株为66.4%，比rLV-M株增加了约10%的感染性；rLV-M1株和rLV-M2株分别为45.9%和48.5%，均比rLV-M株降低了约10%的感染性；rLV-M4株为38.5%，比rLV-M株降低了约20%的感染性；rLV-M5株最低，为28.1%，比rLV-M株降低了约50%的感染性。结合前述糖链结构检测结果进一步分析后提示，改变的糖链结构可能影响了GP上病毒吸附蛋白（VAP）的构象或糖蛋白本身的正确折迭，从而引起病毒感染性的改变；新增糖链的数量越多、结构越复杂，病毒的感染性越低；GalNAcβ-1,4GlcNAc糖链结构的存在是感染性高低的重要决定因素之一。2．将6株组重组假病毒通过肌肉注射免疫C57BL/6小鼠，以空载体、生理盐水及HFRS灭活疫苗为对照，通过ELISA及微量细胞培养中和试验对各组小鼠体液免疫应答的情况进行了检测。ELISA结果显示，rLV-M、rLV-M1、rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4及rLV-M5分别免疫的小鼠血清中均可检测出抗HTNV GP的特异性抗体，其几何平均滴度（GMT）分别为134.5、123.4、134.5、134.5、123.4和134.5，各组间无显着差异（P＞0.05）；灭活疫苗对照组小鼠血清中抗GP抗体的GMT为146.7，与各实验组间亦无显着差异（P＞0.05）。微量细胞培养中和试验结果显示，rLV-M、rLV-M1、rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4及rLV-M5分别免疫的小鼠血清中均可检测出中和抗体，其GMT分别为103.8、103.8、95.1、113.1、95.1和87.2，各组间无显着差异（P＞0.05），但均高于GMT为16.8的灭活疫苗对照组（P＜0.05）。3．通过ELISPOT的方法对各组免疫小鼠脾细胞分泌INF-γ、IL-2、IL-10及IL-4的水平进行了检测。结果表明，各重组假病毒免疫组小鼠分泌INF-γ、IL-2、IL-10及IL-4的水平均无显着差异（P＞0.05），且均高于生理盐水对照组小鼠（P＜0.05）；各重组假病毒免疫组小鼠分泌INF-γ、IL-2的水平均低于灭活疫苗对照组小鼠（P＜0.05），而与rLV-ZsGreen对照组小鼠无显着差异（P＞0.05）；各重组假病毒免疫组小鼠分泌IL-4、IL-10的水平与疫苗对照组之间无显着差异（P＞0.05），且均高于rLV-ZsGreen对照组小鼠（P＜0.05）。细胞因子检测结果表明，所有含HTNV GP的重组假病毒均可刺激小鼠脾细胞分泌IL-4、IL-10水平增高，而分泌INF-γ、IL-2水平与rLV-ZsGreen对照组无明显的差别，提示含HTNV GP的重组假病毒作为免疫原诱导宿主体内产生了以体液免疫为主的应答，且突变株与非突变株重组假病毒之间没有明显的差异。4．用HTNV76-118病毒株对上述各组免疫的C57BL/6小鼠进行病毒攻击后，ELISA双抗体夹心法对各组小鼠肝脏和脾脏中HTNV抗原检测结果表明，与rLV-ZsGreen对照组和生理盐水对照组相比，采用各重组假病毒免疫小鼠，对HTNV的感染均有一定的保护作用（P＜0.05），而各重组假病毒组之间的保护作用无显着差异（P＞0.05）；各重组假病毒免疫组对小鼠的保护作用均弱于灭活疫苗免疫组（P＜0.05）。【结论】本研究采用定点突变的方法，成功获得了含有GFP报告基因的糖基化位点突变株（rLV-M1、rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4、rLV-M5）和非突变株（rLV-M）共6株HTNV重组假病毒。凝集素芯片检测结果表明，HTNV Gn及Gc上每一个糖基化位点的变化均引起了重组假病毒自身糖链结构的改变；进一步结合感染性检测结果分析提示，改变的糖链结构可能影响了HTNV GP上VAP的构象或糖蛋白本身的正确折迭，从而引起重组假病毒感染性的改变；新增糖链的数量越多、结构越复杂，重组假病毒的感染性越低；GalNAcβ-1,4GlcNAc糖链结构的存在是重组假病毒感染性高低的重要决定因素之一，提示通过限制或修饰该糖链结构很可能影响重组假病毒对靶细胞的感染性，从而为HTNV的防治提供新的靶向分子。动物实验结果显示，所有含HTNV GP的重组假病毒免疫的小鼠均可以引起体液免疫为主的HTNV特异性免疫应答，能够产生较高滴度的中和抗体且对小鼠感染HTNV有一定的保护作用。但由于改变的糖链结构可能没有位于HTNV主要抗原表位的附近，或突变单个糖基化位点引起的糖链结构的改变对抗原表位的整体空间结构影响不大，因此单个糖基化位点的突变对GP的免疫原性并没有明显的影响。此外，构建的含有HTNV GP的重组假病毒能够诱导机体产生较高滴度的中和抗体，也为我们进一步优化汉坦病毒基因工程疫苗的设计提供了良好的思路和实验依据。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
汉滩病毒结构蛋白论文参考文献
[1].马樱,唐康,张宇丝,张春梅,张赟.汉滩病毒结构蛋白串联抗原表位的分子设计及免疫原性评价[C].第十二届全国免疫学学术大会摘要汇编.2017
[2].于澜.糖基化对汉滩病毒包膜糖蛋白重组假病毒糖链结构及生物学特性影响的初步研究[D].第四军医大学.2014
[3].闫果林.汉滩病毒结构蛋白线性B细胞表位的筛选和鉴定[D].第四军医大学.2011
[4].高娟,杨守京,刘彦仿.汉滩病毒结构蛋白与该病毒感染诱导表达的多种热休克蛋白的研究[J].中华传染病杂志.2004
[5].罗雯,徐志凯,张芳琳,阎岩,吴兴安.汉滩病毒结构蛋白昆虫细胞融合表达产物的免疫原性评价[J].免疫学杂志.2002
论文知识图
