导读:本文包含了胰蛋白酶样酶论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:胰蛋白酶,丝氨酸,蛋白酶,磷虾,黄粉虫,肿瘤,南极。
胰蛋白酶样酶论文文献综述
严茹红[1]（2016）在《人气道胰蛋白酶样蛋白酶4在急性髓细胞性白血病中的研究》一文中研究指出第一章:HATL4在急性髓细胞性白血病中的表达及预后相关性研究目的:II型跨膜丝氨酸蛋白酶(Type II transmembrane serine proteases,TTSPs)是一类通过氨基末端跨膜区域锚定在细胞膜上的丝氨酸蛋白酶。人类TTSPs共有17个成员,在生理及病理过程中起着广泛而重要的作用,其功能异常导致癌症、缺铁性贫血、高血压、耳聋等。许多研究证实TTSPs与实体肿瘤的发生发展关系密切。我们实验室对TTSPs在恶性血液疾病中的作用开展了相关研究。基于前期研究结果,我们发现人气道胰蛋白酶样蛋白酶4(Human airway trypsin-like protease 4,HATL4)分子在急性髓细胞性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)患者骨髓细胞中异常表达。在本研究中,我们以HATL4作为重点研究对象,深入探讨该分子在AML发生发展中的作用及潜在机制,以及成为疾病诊断、预后指标或治疗靶点的可行性。为进一步研究TTSPs的功能以及它们在血液恶性肿瘤中的作用提供依据,也为TTSPs在肿瘤中的研究拓宽新的角度和视野。研究方法:1.收集恶性血液疾病患者骨髓标本,分离骨髓中的白细胞用于以下各种实验。2.利用逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription PCR,RT-PCR)和实时定量PCR(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR)对人恶性血液病细胞系和患者骨髓细胞中HATL4 m RNA的表达进行分析。3.采用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测恶性血液病细胞系和白血病患者骨髓细胞中HATL4蛋白的表达。4.使用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)和免疫荧光染色检测正常人外周血(Normal peripheral blood,NPB)白细胞和AML细胞系THP-1及AML患者骨髓细胞中HATL4蛋白的表达与定位。5.利用q RT-PCR检测AML患者治疗后骨髓细胞中HATL4 m RNA的表达并分析其与临床参数的相关性。研究结果:1.HATL4 m RNA在AML来源细胞系(HEL、SHI-1和THP-1)和慢性粒细胞性白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)来源细胞系(KU-812、MEG-01和K562)中表达,而在其它恶性血液病细胞系中不表达。另外,HATL4 m RNA在AML患者骨髓细胞中异常髙表达,而在正常人外周血、骨髓和其他白血病如CML、急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)、CLL(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)患者骨髓细胞中检测不到。2.Western blotting结果显示HATL4在AML患者骨髓细胞中异常表达,而在其它白血病患者骨髓细胞中未检测到HATL4蛋白的表达,与m RNA表达结果一致。3.流式细胞术发现HATL4蛋白表达于AML患者骨髓细胞的粒细胞和单核细胞表面上,阳性率均为100%,不表达于NPB细胞及T或B淋巴细胞表面上。免疫荧光染色证实,HATL4定位于THP-1和AML骨髓细胞的膜表面。4.在105例治疗后AML病人骨髓标本中,HATL4 m RNA阳性19例,阴性86例。基于美国国立综合癌症网络实践指南分级,HATL4表达阳性病人为预后等级差(47.37%)或中等(52.63%),而在表达阴性病人中,小部分(4.65%)是预后等级差,大部分是预后等级中等(69.77%)和良好(25.58%)。在相关性分析中,骨髓细胞HATL4 m RNA表达与患者微小残留病灶(Minimal residual disease,MRD)和预后等级相关,与其他参数如:年龄、性别、亚型等无显着相关性。Kaplan-Meier法分析显示,HATL4阳性病人无进展生存期显着短于阴性病人(p=0.0299)。结论:本章节研究发现,AML初诊患者骨髓细胞高表达HATL4 m RNA和蛋白,提示HATL4可能作为诊断AML新的生物标志物。此外,AML患者治疗后HATL4的表达与MRD和预后等级相关,HATL4表达水平越高,复发的可能性越大,预后等级越差。此外,HATL4表达阳性的患者无进展生存期明显缩短,预示HATL4阳性病人预后不良。因此,HATL4在AML患者骨髓细胞中的异常高表达,有望应用于AML的临床早期诊断、靶向治疗及预后评估。第二章:HATL4的肿瘤细胞生物学体外研究研究目的:在第一章中,我们发现HATL4在AML患者骨髓肿瘤细胞中异常高表达,并且该表达与AML病人预后不良相关。这些结果提示,HATL4在肿瘤细胞的异常表达可能与AML的病理过程相关。我们推测,HATL4的表达可能影响AML细胞的肿瘤生物学功能,从而参与AML的发生发展。因此,本研究中我们选用了内源性表达HATL4的急性髓系白血病细胞系THP-1作为研究对象,通过特异性沉默HATL4 m RNA的表达,在体外水平研究HATL4对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,探讨HATL4在AML细胞生物学中的作用及可能机制。研究方法:1.构建特异性干扰HATL4的sh RNA(Short hairpin RNA)慢病毒载体,利用磷酸钙沉淀法制备慢病毒,侵染AML系THP-1细胞,干扰HATL4 m RNA的表达,用q RT-PCR和Western blotting技术检测慢病毒干扰效率。2.用FCM检测对照组和干扰组中绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的阳性率,以THP-1细胞为阴性对照。3.以构建的HATL4-pc DNA3.1全长基因为模板,采用定点突变,构建HATL4突变体。利用瞬间高压电穿孔细胞膜,将HATL4突变体转入到已特异性沉默HATL4的细胞中,该突变体不能被sh RNA特异性沉默,从而在sh RNA干扰后的THP-1细胞中恢复HATL4的表达。4.通过流式分选(Flow sorting),用间接荧光染色法将上述电转化表达HATL4突变体的细胞分选出来。5.利用细胞增殖实验(Cell counting kit-8,CCK-8)检测特异性沉默HATL4m RNA表达后对THP-1细胞增殖能力的影响。6.采用细胞迁移实验(Transwell migration assay)检测HATL4表达下调后THP-1细胞迁移能力的改变。7.通过基底膜侵袭实验(Transwell Matrigel invasion assay)检测HATL4表达下调后THP-1细胞侵袭能力的改变。另外,在实验中加入基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)抑制剂GM6001,观察HATL4沉默前后THP-1细胞侵袭Matrigel能力的改变。8.收集HATL4沉默前后THP-1细胞的培养上清,通过明胶酶谱法分析HATL4表达水平高低对上清中MMP-2和MMP-9活性的影响。9.转染表达HATL4于中国仓鼠卵(Chinese hamster ovary,CHO)细胞膜上,研究HATL4对重组pro-MMP-2蛋白的活化,用MMP-2活性试剂盒检测上清,以此验证HATL4是否参与pro-MMP-2酶原的激活。研究结果:1.我们采用si RNA特异性沉默HATL4 m RNA的表达。用含sh H(包含特异性沉默HATL4的sh RNA核苷酸序列,命名为干扰组)和sh NC(以sh H序列为靶序列打乱的核苷酸序列,命名为对照组)目的质粒的病毒侵染THP-1细胞,培养72 h后,经过FCM检测细胞中GFP的阳性率(即病毒侵染效率)大于99%。再经q RT-PCR检测干扰组的HATL4 m RNA表达抑制率大约是70%,因此筛选到两组对照组(sh NC1和sh NC2)和干扰组(sh H1和sh H2)细胞。2.将构建的两个HATL4突变体,电转导入两个干扰组细胞(sh H1和sh H2)中,培养扩大后,间接荧光染色,经流式分选得到HATL4突变体表达阳性细胞(命名为恢复组,sh R1和sh R2)。然后分别用q RT-PCR和Western blotting检测HATL4m RNA和蛋白的表达。与对照组(sh NC1和sh NC2)相比,干扰组(sh H1和sh H2)细胞中,HATL4 m RNA和蛋白表达抑制率约70%。HATL4突变体重新表达的两个恢复组(sh R1和sh R2)细胞株中,HATL4 m RNA和蛋白的表达又恢复到对照组水平。结果表明sh RNA介导的HATL4沉默是特异的,这些细胞可用于后续的功能学研究。3.细胞增殖实验表明,特异性沉默HATL4表达以及沉默后又恢复HATL4表达对THP-1细胞的增殖能力没有明显改变。4.细胞迁移实验表明,降低HATL4表达对THP-1细胞的迁移能力没有明显改变。5.基底膜侵袭实验表明,抑制HATL4表达后,THP-1肿瘤细胞对Matrigel的侵袭能力显着降低。此外,加入MMP抑制剂GM6001明显降低对照组和干扰组细胞侵袭Matrigel的能力,说明HATL4增强THP-1细胞侵袭能力至少在一定程度上是通过MMPs介导的。6.Western blotting结果显示对照组、干扰组和恢复组THP-1细胞上清中pro-MMP-2总量基本相同,但明胶酶谱实验提示,干扰组细胞中活化的MMP-2(~62k Da)和MMP-9(~83 k Da)表达明显减弱,并且以活化的MMP-2条带减弱为主。这些结果提示,HATL4表达降低可能抑制MMP-2酶原的激活。7.检测到HATL4过表达的CHO细胞上清中MMP-2酶原的激活显着增强,提示HATL4可能是通过激活pro-MMP-2生成MMP-2发挥其蛋白水解功能,降解基底膜,增强肿瘤细胞的侵袭性。同时明胶酶谱实验也证实有活化的MMP-2生成。结论:在体外细胞实验中,HATL4的表达不改变AML来源的THP-1细胞的增殖和侵袭,但能增强AML来源的THP-1细胞侵袭Matrigel以及降解明胶的能力。我们的结果还提示,HATL4可能是主要通过激活pro-MMP-2,从而增强肿瘤细胞降解基底膜的侵袭能力。第叁章:HATL4在小鼠肿瘤模型中的生物学研究研究目的:在第一章中,我们发现蛋白酶HATL4在AML细胞中异常高表达,而且HATL4的表达与AML病人治疗后预后不良相关,提示HATL4在AML的发病机制中起重要作用。在第二章中,我们发现HATL4能够增强AML来源的THP-1细胞侵袭Matrigel的能力。另外,我们通过明胶酶谱等实验发现HATL4可能是通过激活MMPs,尤其是MMP-2,从而促进细胞基底膜降解,增强肿瘤细胞的侵袭性。为了进一步证实我们的发现,在本章研究中,我们选用裸小鼠作为研究对象,将上述对照组、干扰组和恢复组细胞进行小鼠皮下荷瘤试验,观察成瘤大小,从体内水平来研究HATL4对肿瘤细胞增殖、凋亡和血管生成等能力的影响,探讨HATL4在AML发生发展中的作用及潜在机制。研究方法:1.将上述对照组、干扰组和恢复组THP-1细胞扩增培养后,皮下接种六周龄雄性裸小鼠后肢内侧,定期观察各组成瘤情况,测量肿瘤的长宽,计算肿瘤体积。2.用免疫组织化学法对瘤组织细胞进行Ki-67和CD34染色,分别检测瘤组织中细胞增殖和血管表达情况。3.通过脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Td T-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL),对叁组裸鼠肿瘤组织切片进行细胞凋亡检测。研究结果:1.接种第10天后,可以观察到裸小鼠后肢内侧肿瘤形成。第24天后,干扰组细胞(sh H1和sh H2)接种的小鼠肿瘤增长速度显着低于相应的其它两组。第36天后,小动物活体成像观测到荧光信号出现在肿瘤接种部位。在干扰组小鼠,肿瘤荧光信号较弱,且成瘤体积小,平均肿瘤体积和重量均明显小于其它两组。2.与相应的对照组和恢复组相比,干扰组小鼠肿瘤组织切片中Ki-67阳性细胞数明显减少。这一结果提示抑制HATL4的表达降低了THP-1细胞在小鼠体内的增殖能力。因此HATL4在体内可能通过促进THP-1细胞的侵润和增殖能力而发挥促肿瘤生长的效应。3.在叁组裸鼠肿瘤组织切片中,计数各500个细胞中TUNEL阳性细胞数,统计结果显示叁组阳性率没有显着性差异,提示干扰组的THP-1细胞在裸鼠瘤组织中细胞凋亡没有发生明显改变。因此,移植瘤在干扰组裸鼠体内生长速度减缓以及瘤体积的减小并不是由于细胞凋亡增加而引起的。4.用血管标记物CD34对瘤组织血管进行染色并统计,发现叁组的瘤组织血管数量没有明显差异,提示HATL4的表达与否并不影响THP-1细胞移植瘤内血管的生成。因此,THP-1细胞在裸鼠体内的成瘤机制和生长速度与血管生成没有直接关系。结论:在裸鼠体内肿瘤模型中,HATL4可以促进THP-1来源的肿瘤细胞增殖,加快肿瘤生长速度。这一结果提示,HATL4可能参与AML的病理过程,促进AML的发生发展。总之,我们首次发现II型跨膜丝氨酸蛋白酶HATL4在AML初诊病人中异常高表达,提示HATL4可以成为一个诊断AML新的生物标志物。我们的结果也显示AML患者治疗后骨髓细胞中HATL4的表达与MRD和预后等级呈显着相关。因此,HATL4在AML骨髓细胞中的异常高表达,有望应用于AML的临床早期诊断、靶向治疗及预后评估。在HATL4的作用机制方面,我们发现HATL4能激活MMPs,特别是MMP-2,通过降解细胞外基质,促进肿瘤细胞的侵袭和生长而参与AML发生发展的病理过程。(本文来源于《苏州大学》期刊2016-05-01）
马校卫[2]（2013）在《基于宏基因组筛选胰蛋白酶样酶基因及慢性牙周炎龈下菌斑细菌群落结构分析》一文中研究指出牙周炎是以牙龈红肿、出血、溢脓、龈肉萎缩、牙龈外漏、牙齿松动为特征的多因素疾病,主要病理变化经过牙龈炎症和出血、牙周袋形成、牙槽骨的丢失、牙齿的松动和移位导致牙齿丧失。牙周炎是人类口腔中常见疾病之一,根据第叁次全国口腔健康流行病调查,当前我国成年人中80-97%患有不同程度的牙周疾病,其中慢性牙周炎是牙周炎的一种。美国进行流行病学研究估计,超过四百万45岁以上的美国人患有牙周炎疾病。本研究第一部分以中度慢性牙周炎患者龈下菌斑为材料,采用宏基因组学方法筛选胰蛋白酶样酶基因。首先提取中度慢性牙周炎患者龈下菌斑总DNA,利用pWEB-TNCTM Fosmid Cloning Kit,构建了一个含有6500个克隆子的中度慢性牙周炎患者龈下菌斑宏基因组文库。平均每个克隆子插入基因片段的大小为30Kbp。整个宏基因组文库外源DNA容量为200M bp。随机挑选的12个克隆子经BamH I酶切鉴定,克隆子的插入片段具有随机多样性。用BANA方法从宏基因组文库中筛选得到了一个可以表达胰蛋白酶样酶的克隆子E5,对这个克隆子进行16S rDNA分子鉴定,克隆子E5的16S rDNA与假单胞菌属(Pseudomonas)的16S rDNA的核酸序列具有97.5%的相似性。提取克隆子E5的质粒,构建亚克隆文库,通过进一步的筛选,将产胰蛋白酶样酶的基因片段缩小至2671bp左右,将该基因片段进行全序列测序,分析表明该核酸序列包含了一个由1071个核苷酸组成的开放阅读框,该开放阅读框编码的氨基酸序列与胰蛋白酶样酶的丝氨酸蛋白酶(trypsin-like serine protease)氨基酸序列有75%的相似性。本论文第二部分运用细菌的核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析(ARDRA)、单链构象多态性(SSCP)技术对慢性牙周炎患者菌斑的群落结构进行多样性分析,采用ARDRA分析中度慢性牙周炎菌斑的细菌菌群,建立了龈下菌斑、唾液和龈沟液16S rDNA文库。其中龈下菌斑16S rDNA文库中的92个克隆子得到61种OUTs,唾液16S rDNA文库中的96个克隆子得到34种OUTs,龈沟液16S rDNA文库中的94个克隆子得到42种OUTs,在文库标准多样性指数方面,龈下菌斑样品的香侬-威纳指数(Shannon-Wiener index (H))、辛普森指数(Simpson index (D))和丰富度指数(Margalef's richness index (R))分别为3.92、0.938、38.23,均大于龈沟液样品的3.37、0.867、17.29和唾液样品的3.21、0.863、12.26,龈下菌斑样本具有更高的物种多样性。采用PCR-SSCP技术研究健康者和中度、重度慢性牙周炎患者的龈下菌斑菌群结构,通过提取不同炎症程度病人的龈下菌斑提取总DNA,分别扩增其16S rDNA的V4-V5区域,将其扩增产物进行酶切、变性,得到的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。慢性牙周炎的几种主要致病菌如中间普氏菌(Prevotella intermedia)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、直肠弯曲菌(Campylobacter rectus)、小韦荣球菌(Veillonella parvula)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)在本实验中均有较高的检出率,且随着慢性牙周炎的发生和发展,其检出率也变高。(本文来源于《福建师范大学》期刊2013-06-01）
林泽飞[3]（2013）在《黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶的基因克隆及在毕赤酵母中的表达和活性检测》一文中研究指出黄粉虫(Tenebrio molitor L.)在昆虫分类学上隶属于鞘翅目,拟步行虫科,粉虫甲属。目前有关研究已经证明,黄粉虫体内含有多种重要生物活性物质,包括蛋白质、氨基酸、脂肪、微量元素和维生素等；大量实验也证明,以黄粉虫为原料制成的保健品具有提高人体免疫力、抗疲劳、降低血脂、抗癌以及促进新陈代谢等功效。目前,国内主要在其生物学特性和人工养殖技术方面有所研究,作为一种高蛋白营养品,对其功能性蛋白的研究较为罕见。国外对该虫已引起广泛关注,已有对其消化酶的有关研究,和少量关于其具有抑菌和溶血栓作用方面的工作,但对黄粉虫胰蛋白酶样酶的提取、功能以及其基因方面的研究尚少,而对该基因的克隆表达的研究还未见报道。本论文的研究是在课题组前期对其纤溶酶基因进行克隆的基础上,进一步探讨黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶(TMTLSP)基因克隆并在毕赤酵母中表达。毕赤酵母是一种甲基营养型酵母,具有高效表达外源蛋白的能力、完善的分泌系统和翻译后加工机制,适于表达真核蛋白。本文采用了PCR技术,以含有TMTLSP cDNA的质粒作为模板,扩增出TMTLSP基因片段；将克隆获得的目的基因插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,经测序无误后,获得重组表达质粒pPIC9K-TMTLSP；将重组表达质粒线性化后电击转化到毕赤酵母GS115中,经筛选并PCR验证获得多拷贝整合型酵母工程菌；对工程菌进行发酵,甲醇诱导表达,取样进行SDS-PAGE分析,结果显示在26KD左右有阳性条带,而空质粒转化子没有；经纤溶平板实验验证,该表达蛋白具有生物活性。黄粉虫纤溶酶为一种新型强溶栓蛋白酶,开展对其真核生物基因表达的研究具有重要意义,本研究的实施构建了真核表达黄粉虫胰蛋白酶样酶工程菌,为一种新型溶栓基因工程药物的诞生奠定重要的理论与实验基础。(本文来源于《广东工业大学》期刊2013-05-01）
叶韵[4]（2012）在《黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶基因克隆与原核表达研究》一文中研究指出随着社会发展以及人们生活水平的提高,由血栓引起的血栓性疾病是一种常见心脑血管病。每年在我国需要进行血栓溶解治疗的人就超过300万,而死于心脑血管疾病的人每年大约为200万,占总因病死亡人数的40.7%,与癌症相比,位于各类死因之首。因此,作为威胁人类健康的疾病,心脑血管疾病已成第一位。溶栓剂作为一种治疗血管疾病的抗栓药物,其作用机理主要通过激活纤维蛋白溶解酶原活化成为纤维蛋白溶解酶,使之催化血栓的基质纤维蛋白水解；另外一些溶栓剂也可直接水解纤维蛋白,同样使血管再次通畅。及时给予溶栓剂的治疗,使闭塞血管再通,重要脏器迅速获得血液再灌注,扼制脏器衰竭的发生是很好的治疗方法。因此,效果良好、溶血副作用小的溶血栓药物的寻找和研制,对于有效地治疗和拯救人类于心脑血管疾病具有十分重要的意义。黄粉虫(Tenebrio molitor L.)。体内多种蛋白质、氨基酸、脂肪、微量元素和维生素等物质,经实验证明,以黄粉虫为原料制成的保健品可提高人体免疫力,抗疲劳,降低血脂,抗癌,促进新陈代谢等功效。国内主要研究其在饲料中应用,作为一种高蛋白营养品,对其蛋白的功能以及功能性蛋白的研究较少。在国外,现阶段对黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶的提取、功能,以及其基因方面的研究不多,而对该基因的克隆表达的研究还没出现。本研究是对黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶(TMTLSP)进行全基因克隆以及原核表达。首先,分别利用异硫氰酸胍法和柱式小量提取法提取黄粉虫总RNA,比较两种提取方法在含量、纯度、完整度上的优异,以获得高质量的黄粉虫总RNA,为下一步实验做准备。然后,参照地鳖(Eupolyphaga sinensis)纤溶酶(fibrinolytic enzyme)基因序列的简并引物,进行温度梯度PCR。以得到的扩增产物为基础,采用Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE)法扩展蛋白基因全长cDNA,并命名为黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶(Tenebrio molitor Trypsin-like Serine Protease, TMTLSP)。 TMTLSP全长为869bp(GenBank序列号为JN662461),开放阅读框为777bp,编码258个氨基酸,并具有Trypsin-like特有的起始位点、活性中心以及预计底物结合位点。经过比对分析,该基因编码的氨基酸序列与多种昆虫如赤拟谷盗、谷蠹、光亮扁角水虻、美洲大蠊的胰蛋白酶或丝氨酸蛋白酶有较高的相似性。同时对利用pET28a(+)、大肠杆菌BL21原核表达体系对黄粉虫胰蛋白酶样酶进行原核表达,再进行目标蛋白的纯化以及初步复性。为丝氨酸胰蛋白酶样酶的提取以及研究提供更为广泛的研究材料以及研究依据。(本文来源于《广东工业大学》期刊2012-05-22）
袁哲[5]（2012）在《胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因在仿刺参再生过程中的表达分析》一文中研究指出胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶在动物的许多生理过程中起着十分重要的作用,包括创伤修复,炎症反应,凝血反应,再生等功能。本文通过基因克隆(RACE)技术首次获得了仿刺参胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的全长cDNA序列,该序列含有1216bp碱基对,5’端有39bp的非编码区,3’端有355bp的非编码区。通过基因步移的实验手段得到了胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因包括内含子和外显子在内的DNA序列,该序列包括含有4个内含子序列和5个外显子序列。用原位杂交技术来检测胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶在不同组织中的表达,结果显示胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶在体壁,肠,呼吸树等组织中均有分布,其中在肠中的信号最强。用Realtime-PCR技术分别检测胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因在不同组织的不同再生阶段的表达模式。结果显示在再生一小时内的体壁中,胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因呈现出短暂并明显的上调趋势,接着表达量下调,随着组织的再生,胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因表达量上调,最后达到正常水平。在肠和呼吸树中,胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的表达量随着组织的再生呈现出上升趋势。但是在这些组织中胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的表达量一直低于正常水平直到再生出新组织表达量恢复到正常水平。胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因在仿刺参不同再生阶段的表达量的变化表明其在再生过程中起着重要的作用。对仿刺参胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因在其不同再生过程中表达模式的研究对于阐明仿刺参再生调控通路和相关分子机制的有着重要意义。同时,对于进一步了解仿刺参苗种生产和养殖过程中吐肠的发生和防治及提高苗种成活率有着一定的应用价值。(本文来源于《辽宁师范大学》期刊2012-05-01）
叶韵,韩雅莉,黄明星,孙建平,代春迎[6]（2012）在《黄粉虫胰蛋白酶样酶基因TMTLSP全长cDNA的克隆和序列分析》一文中研究指出以黄粉虫(Tenebrio molitor)幼虫全RNA逆转录得到的cDNA为模板,参照地鳖(Eupolyphagasinensis)纤溶酶(fibrinolytic enzyme)简并引物,进行温度梯度PCR.以得到的扩增产物为基础,采用RACE得到基因全长cDNA,命名为黄粉虫胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(Tenebrio molitor trypsin-likeserine protease,TMTLSP).TMTLSP全长869 bp(GenBank No.JN662461),开放阅读框为777 bp,编码258个氨基酸,并具有蛋白酶样特有的起始位点、活性中心预计底物结合位点.经过比对分析,该基因编码的氨基酸序列与赤拟谷盗、谷蠹、光亮扁角水虻、美洲大蠊等多种昆虫的胰蛋白酶或丝氨酸蛋白酶有较高的相似性.本研究将为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的提取及研究提供更为广泛的材料及研究依据.(本文来源于《中国生物化学与分子生物学报》期刊2012年02期）
向宇[7]（2011）在《南极大磷虾（Euphausia superba）胰蛋白酶样酶分离纯化、酶学性质探索及其生物学活性研究》一文中研究指出南极大磷虾隶属于节肢动物门甲壳纲,是南极生态系统的关键物种,资源丰富,具有巨大的开发和利用潜力。国外研究表明,南极大磷虾体内含有多种蛋白酶,能清除机体坏死组织和细胞、治疗角膜碱烧伤和消除牙斑等,具有广泛的医学用途,而其体内蛋白酶活性40%来源于胰蛋白酶。因此,对其胰蛋白酶样酶进行分离纯化,酶学性质探索和生物学活性研究,具有一定的理论和应用价值。本文采用20-70%饱和度硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S100凝胶过滤柱层析和DEAE Sepharose-F.F离子交换柱层析,纯化得到一种胰蛋白酶TLEⅠ,分子量大约在30.0KDa,纯化倍数为3.19。胰蛋白酶酶学性质研究发现:酶促反应的速率受pH、温度影响。在37°C,以BApNA为底物的反应体系中,在较广泛的pH范围(3.0~11.0)内,酶具有活性,最适宜反应pH在7.0~9.0之间;在pH 8.0,以BApNA为底物的反应体系中,酶在较广泛的温度范围(4-80°C)内具有活性,反应最适宜温度为30°C~50°C。Mg~(2+)、Ca~(2+)(0~0.5 mmol/L)对胰蛋白酶有一定的激活作用。Fe~(3+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、丙叁醇和丙酮对胰蛋白酶有一定的抑制作用。Mn~(2+)、乙醇和二甲基亚砜在低浓度时对酶起激活作用,高浓度下表现为抑制作用。建立兔机械创伤模型,以提取的粗酶、纯化酶、木瓜蛋白酶和生理盐水分别涂抹伤口,以肉眼观察和伤口愈合面积为指标对比各组实验结果。结果显示,粗酶和纯化酶都有很好的效果,粗酶更佳。分别采用番泻叶、大黄、5-羟色胺(5-HT)建立小鼠腹泻模型1h后,以生理盐水为阴性对照,思密达为阳性对照,分别灌胃不同剂量(20mg.kg~(-1)和40mg.kg~(-1))的南极磷虾蛋白酶制剂,统计6h内小鼠腹泻发生率和腹泻累积次数。结果显示,南极磷虾蛋白酶可显着降低番泻叶引起的小鼠腹泻次数,降低大黄,5-羟色胺引起的小鼠腹泻次数。采用右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠溃疡性结肠炎(UC)模型,以生理盐水为阴性对照,柳氮磺胺吡啶为阳性对照,分别灌胃不同剂量(20mg.kg~(-1)和40mg.kg~(-1))的南极磷虾蛋白酶制剂,通过肉眼及实体观察,EGF的测定,组织切片观察对比各组实验结果。结果显示:灌胃南极磷虾蛋白酶的小鼠在饮用DSS诱导UC后,能够保持良好的精神状态,少有便血现象,并能抑制小鼠体重的减轻;同时,南极磷虾蛋白酶能够明显提高UC小鼠血液中EGF表达水平,从组织切片结果来看,南极磷虾蛋白酶也能降低溃疡症状的发生,其作用效果在一定程度上与其浓度成正比。(本文来源于《中国海洋大学》期刊2011-03-01）
筱雅[8]（2010）在《芹黄素、白杨黄素和木犀草素选择性抑制肿瘤细胞胰凝乳蛋白酶样和胰蛋白酶样蛋白酶体催化活性》一文中研究指出泛素-蛋白酶体途径在调节细胞凋亡和细胞周期中起重要作用。蛋白酶体功能由3种主要的催化活性介导,即胰凝乳蛋白酶样(CT-L)、胰蛋白酶样(T-L)和肽基谷氨酰肽水解样(PGPH)活性。近期研究显示,蛋白酶体抑制剂具抗肿瘤活性并已用于肿瘤(如(本文来源于《现代药物与临床》期刊2010年04期）
吴志强[9]（2007）在《太平洋磷虾（Euphausia pacifica Hansen）胰蛋白酶样酶酶学性质及基因片段研究》一文中研究指出本文通过分离纯化太平洋磷虾胰蛋白酶样酶,对其相关的酶学性质进行研究。并克隆其基因进行序列分析,探讨其酶学性质的分子机理。以期为胰蛋白酶样酶的理论研究及其医学、工业应用提供理论基础。采用双向电泳及生物大分子质谱技术,在太平洋磷虾粗酶液内鉴定到至少两种胰蛋白酶样酶。太平洋磷虾粗酶液经35~65 %饱和度硫酸铵分级沉淀,DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析, Sephadex G100凝胶过滤层析以及Benzamidine Sepharose 4B亲和层析得到两种胰蛋白酶样酶,TLE I和TLE II,相对分子量分别为32.9和32.3 kDa。TLE I比活力为91.4 BApNA单位每毫克蛋白,纯化倍数为177;TLE II比活力为113 BApNA单位每毫克蛋白,纯化倍数为218。两种胰蛋白酶样酶促反应的速率受pH、温度影响。在37°C,以BApNA为底物的反应体系中,两种酶在较广泛的pH范围(6.0~11.0)内具有较高活性,反应最适宜pH在9.0~10.0之间;在pH 9.0,以BApNA为底物的反应体系中,两种酶在较广泛的温度范围(20~70°C)内具有较高活性,反应最适宜温度为40 ~50°C。两种胰蛋白酶样酶在低于40°C温度范围内保持稳定,在高于40°C时稳定性降低。Mg2+(≥0.3 mmol L-1)和Ca2+(≥0.2 mmol L-1)对两种胰蛋白酶样酶有一定的激活作用,Zn2+(≥0.1 mmol L-1)、Cu2+(≥0.2 mmol L-1)、Pb2+(≥0.1 mmol L-1)、Hg2+(≥0.1 mmol L-1)对两种酶均有一定抑制作用,其中Pb2+和Hg2+对两种酶表现出强烈的抑制。乙醇(≤10 %)、丙叁醇(≤5 %)和二甲亚砜(≤5 %)在低浓度时对两种胰蛋白酶样酶活性无明显影响,高浓度(分别为≥15 %、≥10 %、≥10 %)下表现为强烈抑制作用;丙酮(≥5 %)对两种酶有较强烈的抑制作用。丝氨酸蛋白酶专一性抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)、大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)以及胰蛋白酶专一性抑制剂对氨基苯甲脒(p-amionbenzamidine)、鸡卵类粘蛋白(CEOM)、苯甲脒(benzamidine)、N-对甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲酮(TLCK)对两种胰蛋白酶样酶具不同程度抑制作用,胰凝乳蛋白酶专一性抑制剂N-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲酮(TPCK)对两种胰蛋白酶样酶无抑制作用。证明这两种酶是胰蛋白酶,属于丝氨酸蛋白酶家族。TLE I的米氏常数Km= 0.088 mmol L-1;催化常数(转换数)Kcat=0.84 S-1;表观二级速率常数(专一性常数,转换效率)Kcat / Km =9.54 mmol L-1 S-1;TLE II的Km=0.064 mmol L-1;催化常数(转换数)Kcat=0.98 S-1;表观二级速率常数(专一性常数,转换效率)Kcat / Km =15.3 mmol L-1 S-1。TLE的Kcat/Km较某些生物胰蛋白酶高1.6~6.7倍。Benzamidine对TLE I抑制类型为非竞争性抑制,抑制剂常数Ki=0.07 mmol L-1。组氨酸残基、色氨酸残基是构成TLE I酶活性中心的必需基团。精氨酸残基可能是该酶活性中心结合部位的关键基团。赖氨酸的游离ε-氨基与酶活性有关,巯基可能与酶活性相关。游离羧基不是TLE I活性中心的必需功能基团。太平洋磷虾、南极大磷虾、中国毛虾、中国明对虾、刀额新对虾、脊尾白虾、日本蟳、叁疣梭子蟹、中华绒螯蟹等九种甲壳动物胰蛋白酶基因基因结构基本一致。在同一物种内,至少有叁个基因家族,各家族间第二个内含子有13.2~66.1 %相似度,基因间有65.9~90 %相似度;各家族内部的第二个内含子有1.9~6.2 %的变异,基因间有2.5~6.7 %变异。动物胰蛋白酶接触反应叁联体是保守的,底物结合位点Asp、盐键形成位点Asp以及二硫键形成位点(昆虫缺失两个)在绝大多数物种中也较保守,形成4个二硫键(昆虫只有3个)。系统进化树分析表明物种进化过程中,胰蛋白酶基因分化与演进过程可能与物种分化与演进的过程并不完全一致。甲壳动物胰蛋白酶极性氨基酸如精氨酸含量较低,Arg/(Arg+Lys)比值较低,天冬氨酸、谷氨酸含量较高;非极性氨基酸如异亮氨酸含量较高,而甲硫氨酸、脯氨酸含量较低。这些可能也是甲壳动物对环境理化因子及饵料成分、丰度多变的一种适应。在上述条件下甲壳动物演化出pH、温度稳定性较低但是柔性较高、降解效率较高的胰蛋白酶。(本文来源于《中国海洋大学》期刊2007-06-30）
信玉华,薛毅,闫文娟,唐涛[10]（2006）在《健康牙龈龈下菌斑胰蛋白酶样酶水平的测定》一文中研究指出胰蛋白酶样酶(trypsin-like enzyme,TLE)是造成牙周组织破坏的重要因素之一,Loesche等[1]认为牙周病变中TLE水平与牙周病的严重程度呈显着的正相关。本研究通过苯甲酰精氨酸萘酰胺(benzoyl DL arginine naph(本文来源于《华西口腔医学杂志》期刊2006年05期）
胰蛋白酶样酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
牙周炎是以牙龈红肿、出血、溢脓、龈肉萎缩、牙龈外漏、牙齿松动为特征的多因素疾病,主要病理变化经过牙龈炎症和出血、牙周袋形成、牙槽骨的丢失、牙齿的松动和移位导致牙齿丧失。牙周炎是人类口腔中常见疾病之一,根据第叁次全国口腔健康流行病调查,当前我国成年人中80-97%患有不同程度的牙周疾病,其中慢性牙周炎是牙周炎的一种。美国进行流行病学研究估计,超过四百万45岁以上的美国人患有牙周炎疾病。本研究第一部分以中度慢性牙周炎患者龈下菌斑为材料,采用宏基因组学方法筛选胰蛋白酶样酶基因。首先提取中度慢性牙周炎患者龈下菌斑总DNA,利用pWEB-TNCTM Fosmid Cloning Kit,构建了一个含有6500个克隆子的中度慢性牙周炎患者龈下菌斑宏基因组文库。平均每个克隆子插入基因片段的大小为30Kbp。整个宏基因组文库外源DNA容量为200M bp。随机挑选的12个克隆子经BamH I酶切鉴定,克隆子的插入片段具有随机多样性。用BANA方法从宏基因组文库中筛选得到了一个可以表达胰蛋白酶样酶的克隆子E5,对这个克隆子进行16S rDNA分子鉴定,克隆子E5的16S rDNA与假单胞菌属(Pseudomonas)的16S rDNA的核酸序列具有97.5%的相似性。提取克隆子E5的质粒,构建亚克隆文库,通过进一步的筛选,将产胰蛋白酶样酶的基因片段缩小至2671bp左右,将该基因片段进行全序列测序,分析表明该核酸序列包含了一个由1071个核苷酸组成的开放阅读框,该开放阅读框编码的氨基酸序列与胰蛋白酶样酶的丝氨酸蛋白酶(trypsin-like serine protease)氨基酸序列有75%的相似性。本论文第二部分运用细菌的核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析(ARDRA)、单链构象多态性(SSCP)技术对慢性牙周炎患者菌斑的群落结构进行多样性分析,采用ARDRA分析中度慢性牙周炎菌斑的细菌菌群,建立了龈下菌斑、唾液和龈沟液16S rDNA文库。其中龈下菌斑16S rDNA文库中的92个克隆子得到61种OUTs,唾液16S rDNA文库中的96个克隆子得到34种OUTs,龈沟液16S rDNA文库中的94个克隆子得到42种OUTs,在文库标准多样性指数方面,龈下菌斑样品的香侬-威纳指数(Shannon-Wiener index (H))、辛普森指数(Simpson index (D))和丰富度指数(Margalef's richness index (R))分别为3.92、0.938、38.23,均大于龈沟液样品的3.37、0.867、17.29和唾液样品的3.21、0.863、12.26,龈下菌斑样本具有更高的物种多样性。采用PCR-SSCP技术研究健康者和中度、重度慢性牙周炎患者的龈下菌斑菌群结构,通过提取不同炎症程度病人的龈下菌斑提取总DNA,分别扩增其16S rDNA的V4-V5区域,将其扩增产物进行酶切、变性,得到的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。慢性牙周炎的几种主要致病菌如中间普氏菌(Prevotella intermedia)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、直肠弯曲菌(Campylobacter rectus)、小韦荣球菌(Veillonella parvula)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)在本实验中均有较高的检出率,且随着慢性牙周炎的发生和发展,其检出率也变高。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
胰蛋白酶样酶论文参考文献
[1].严茹红.人气道胰蛋白酶样蛋白酶4在急性髓细胞性白血病中的研究[D].苏州大学.2016
[2].马校卫.基于宏基因组筛选胰蛋白酶样酶基因及慢性牙周炎龈下菌斑细菌群落结构分析[D].福建师范大学.2013
[3].林泽飞.黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶的基因克隆及在毕赤酵母中的表达和活性检测[D].广东工业大学.2013
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